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新分离呼肠病毒的空斑试验及病毒纯化
目的:建立新分离呼肠病毒(reovirus)的空斑技术,进行病毒纯化,为呼肠病毒生物学和分子生物学的研究奠定基础.方法: 4株新分离呼肠病毒的早代毒种经L929细胞连续传代,当产生细胞病变后进行空斑试验,加营养琼脂培养6 d后加中性红,24 h内挑取空斑,扩增一次后做PCR鉴定.取呼肠病毒PCR阳性病毒进行第2次克隆纯化.结果:4株新分离呼肠病毒经L929细胞连续传2～4代,均能观察到明显的细胞病变.用10-3和10-4接种L929单层细胞,第6～7天均能产生空斑,空斑呈圆形,直径为0.2～1.0 mm,并分别测定其空斑滴度(PFU/ml).两次纯化后进行PCR检测,呼肠病毒基因扩增阳性、脊髓灰质炎病毒基因扩增阴性.结论:4株呼肠病毒的空斑出斑规律,通过两次克隆,获得纯化的病毒.
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发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒抗原超速离心纯化方法的建立
目的 建立发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)抗原的超速离心纯化方法.方法 将SFTSV工作种子库毒种接种至Vero细胞,病毒培养物经灭活及浓缩后制备病毒浓缩液.病毒浓缩液通过20％蔗糖超速离心富集分离,再经60％、50％、40％、30％、20％、10％蔗糖密度梯度超速离心进一步纯化,将病毒抗原富集的组分进行合并,经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果 病毒抗原富集于组分22 ～ 26中,合并后经SDS-PAGE分析可见相对分子质量约60 000及28 000的糖蛋白(GP)及核蛋白(NP)条带,纯度约90％,浓度为2.58 mg/ml,且可与兔抗SFTSV全病毒多克隆抗体发生特异性结合.结论 成功建立了SFTSV的超速离心纯化方法,纯化制备出了高纯度的病毒抗原,为SFTSV灭活疫苗的研制奠定了基础.
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Monoliths整体色谱柱在病毒纯化及疫苗生产中的应用
Monoliths整体色谱柱是一种利用原位聚合形成完整连续固定相的新技术,被誉为是第四代层析填料[1-2].与传统的颗粒填充介质相比,不需要填装,制备简单,载量高,物质传输速度快.近年来,由于能够大量并快速地进行生物大分子的分离,Monoliths整体色谱柱在病毒纯化及疫苗生产中得到了广泛应用[3].本文就Monoliths整体色谱柱的类型、特点及其在病毒纯化和疫苗生产中的应用作一简要介绍.
关键词： Monoliths整体色谱柱 病毒纯化 疫苗生产 -
养殖贻贝中观察到一种球形病毒
用电镜负染方法在发病的贻贝内脏团、鳃、外套膜组织匀浆中观察到一种球形病毒粒子,其直径为80～200nm,具囊膜.上述组织超薄切片发现在其结缔组织细胞质中均存在该病毒粒子,带双层囊膜,有"封入体"结构,未见包涵体.在未发病的杂色蛤、香螺、牡蛎等内脏团中也观察到少量同种病毒粒子.用带病毒贻贝组织匀浆投喂和划伤感染不带病毒的绣凹螺,使之成为带病毒状态.采用蔗糖梯度离心法,25 000 r/min,离心3h,可于20%～30%蔗糖层间获得病毒沉淀带.
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提高重组腺病毒载体提纯和滴定效率的研究
目的探讨提取、纯化和滴定重组腺病毒表达载体的有效方法.方法将已用含报告基因β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的重组5型腺病毒载体(Ad5CMVLacZ)转染的人胚肾293细胞从-70℃转移至37℃,反复冻融使细胞发生破溃,病毒从细胞内释放至上清液.在上清液中加入氯化铯,进行密度梯度超速离心,收集和透析病毒液,用空斑形成实验确定病毒的滴度.结果经提取和纯化的Ad5CMVLacZ病毒液清晰无色,用系列稀释法将其配制成10-2～10-13的稀释度,分别转染100%汇合的293细胞,连续追踪观察空斑的形成及其数目变化,直至转染后第10天,10-10稀释度的空斑数不再增加为止,计数其空斑,从而确定出mL病毒的滴度,即空斑形成单位(pfu),终测定得到的结果是3.0×1010pfu/mL.结论用上述方法能制备出优质的重组腺病毒载体,后者足以达到对中枢神经系统损伤和疾病进行基因治疗的要求.
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柯萨奇病毒 A16型快速纯化和中和性单克隆抗体制备与鉴定
目的：建立柯萨奇病毒A16型快速纯化方法，制备中和性单抗，并对单抗进行分析。方法收获CA16培养上清液，超滤浓缩，氯化铯密度梯度离心纯化病毒颗粒，透射电镜鉴定纯化产物。福尔马林灭活CA16，免疫BALB／c小鼠，制备分泌抗CA16特异性单抗的杂交瘤细胞系，用ELISA和中和试验分别对单抗特性进行分析。结果初步建立CA16病毒氯化铯密度梯度纯化方法，电镜显示，病毒颗粒为二十面体立体对称球形结构，病毒直径在20～30 nm间，大小均匀。获得2株分泌抗CA16单抗的杂交瘤细胞系，2株单抗均为IgG2a亚型，Anti／CA16／5效价为103，Anti／CA16／10效价为104。2株抗体的中和效价分别为1∶256和1∶1024。结论初步建立氯化铯密度梯度纯化CA16的方法，筛选出2株具有中和活性的抗CA16单抗，为CA16病毒的基础研究提供重要的原材料。
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肠道病毒71型的快速纯化及其鉴定
目的 建立一种简单、快速有效的从细胞培养物中纯化肠道病毒71(EV71)的方法.方法 EV71病毒在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中增殖后,将获得的细胞培养物经反复冻融、聚乙二醇6000沉淀、超速离心、氯化铯垫层超速离心的方法纯化病毒.用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western blot)和透射电镜(TEM)的方法对纯化病毒进行鉴定,并测定其感染性的滴度及回收率.结果 SDS-PAGE显示出3个条带,相对分子质量分别为3.6×103、3×103和2.6×103与EV71的VP1、VP2和VP3相符合.Western blot证实为EV71特异性条带.经磷钨酸负染后电镜观察,能看到典型病毒颗粒.采用终浓度为10%的聚乙二醇6000沉淀后的病毒的感染性回收率为82.0%,再经氯化铯垫层超速离心后浓缩病毒的感染性回性率为29.0%.结论 聚乙二醇6000沉淀结合氯化铯垫层超速离心的方法比氯化铯密度梯度区带离心方法更简便,易于操作,并且比单独聚乙二醇6000沉淀有更高的纯度,是一种简便、有效的病毒纯化方法.
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ELISA抗体检测试剂盒在狂犬病毒特免血浆筛选中的初步应用
用Sepharose CL 6B纯化灭活的狂犬疫苗原液作为包被抗原,对试剂盒生产工艺进行优化,根据ELISA相对效价和SNT效价的正相关性,设计出能满足大规模狂犬病毒特异性免疫血浆筛选需要的合理可靠的收浆方案.
