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角膜上皮干细胞定位及功能的研究进展
角膜上皮干细胞定位于角膜缘已被广泛认可,并被命名为角膜缘干细胞,且认为角膜缘干细胞在角膜上皮的自我更新和损伤修复中起重要作用.但近年来的一些研究却提出了与之相悖的观点:整个眼表层均含有寡能干细胞,且角膜缘干细胞在维持自我更新及稳态方面并未起到至关重要的作用.这些发现提示可能还有其他干细胞存在并维持着角膜上皮的自我更新,但也有人对这些新观点提出质疑.本文通过对新研究的不同观点及证据的阐述,对近年来角膜上皮干细胞的定位及其功能等方面的进展作一综述.
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角膜上皮干细胞的研究进展
机体所有能自我更新的组织中都有干细胞的存在.干细胞是成熟机体中具有多潜能的细胞,能自我维持,细胞周期长,能进行不对称的细胞分裂,缺乏分化特性,形态和生化处于原始幼稚阶段,是细胞自我更新和增殖的源泉.角膜上皮也存在干细胞.目前对角膜上皮干细胞的研究日益深入,其研究结果在基础研究和临床应用中具有重要作用.
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活体及体外条件下对角膜上皮干细胞的定位
背景：眼表存在两种形式的上皮干细胞即角膜上皮干细胞和结膜上皮干细胞，角膜上皮干细胞在角膜上皮细胞更新和角膜透明的维持方面起着重要作用。
目的：采用活体激光扫描角膜共焦显微镜和免疫荧光染色技术相结合的方法，从活体和体外层面上对角膜上皮干细胞进行定位研究。
方法：收集2009年9月至2012年9月来河南省眼科研究所就诊的单侧角膜缘干细胞缺乏患者，使用活体激光扫描角膜共焦显微镜检查患者双眼，健侧眼为对照。扫描方位依次为中央角膜及上、下、左、右方的角膜缘，记录扫描图像并分析。眼球材料来自于河南省眼库，切取角膜中央和角膜缘组织，组织包埋剂包被、冰冻切片，切片厚度5-7μm；免疫荧光染色技术检测p63、ABCG2、K3和Connexin 43在角膜中央及角膜缘上皮层的表达。
结果与结论：共有24例患者确诊为单侧角膜缘干细胞缺乏，活体激光扫描角膜共焦显微镜下患侧眼角膜病变区可见结膜细胞及杯状细胞；角膜缘区域Vogt栅栏状结构消失，色素细胞消失，取而代之的是大量纤维瘢痕化组织。免疫荧光染色示表达ABCG2和p63的细胞主要在角膜缘上皮基底层，尤其在近结膜侧的角膜缘及角膜缘中间部表达相对较高，而中央角膜上皮层细胞不表达；K3及Connexin43在角膜缘上皮基底细胞层不表达，中央角膜上皮全层表达。通过活体激光扫描角膜共焦显微镜观察及干细胞标记物检测显示角膜上皮干细胞主要存在于角膜缘外2/3区域的Vogt栅栏基底部及钉突结构中。 -
角膜上皮干细胞缺乏的基础与临床
角膜上皮干细胞(corneal epithelial stem cells)的发现及对其生物学特性的逐渐了解,大大增强了人们对部分眼表疾病的认识,针对角膜上皮干细胞缺乏所采取的治疗措施也越来越多地应用于临床.
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异体角膜缘干细胞研究现状
角膜上皮是角膜的前层结构,它具有稳定泪膜、维持角膜的透明性及一定的机械屏障功能.生理情况下角膜上皮不断自我更新,其更新有赖于角膜上皮干细胞(coreal epithelial stem cells)的增殖、分化和移行.
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角膜原位癌起源于角膜上皮干细胞的实验研究
目的 研究角膜原位癌的组织病理学特性,探讨角膜上皮干细胞在角膜原位癌发生过程申的作用.方法 收集8例角膜原位癌标本,常规石蜡包埋切片,HE染色,做形态学检查;并对其做P63和AE5免疫组化研究.结果 病理检查发现角膜原位癌的癌细胞在上皮內高度增生并呈现明显的异形性,增生的细胞主要为基底细胞,上皮下基底膜完整.当用角膜上皮干细胞特异性标记物P63免疫组织化学染色,发现肿瘤区已发生癌变的恶性细胞,细胞核均染成棕色,但外围或表浅的已分化的梭形细胞未见表达,与其邻近的正常角膜上皮细胞也呈阴性反应.结论 角膜原位癌细胞主要由表达P63阳性的肿瘤干细胞和少许不表达P63但表达角质蛋白的分化细胞构成,角膜原位癌起源于角膜上皮干细胞.
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白细胞介素-6对糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化的促进作用和角膜上皮愈合的加速作用
背景 白细胞介素(IL)-6既介导炎症反应过程又在损伤修复中发挥重要作用,但其具体机制及其在糖尿病角膜组织损伤修复中的作用值得探讨. 目的 探讨IL-6在正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞活化和角膜上皮修复过程中的作用及其机制.方法 正常6～8周龄C57B L/6小鼠52只,采用随机数字表法随机分为正常对照鼠32只和糖尿病模型鼠20只,采用50 mg/kg链脲佐菌素连续腹腔内注射5d的方法诱导建立小鼠糖尿病模型.正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠均行角膜上皮刮除术,然后分别于刮除后即刻和48 h结膜下注射IL-6或等容量PBS,采用荧光素染色法评价随时间延长的角膜上皮的愈合情况.体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞(TKE2细胞系),采用结晶紫染色法评估不同质量浓度IL-6处理后细胞克隆率(CFE),并与空白对照组进行比较;采用免疫荧光检测法和Western blot法检测细胞和小鼠再生上皮中干细胞标志物△NP63、Ki67的表达以及关键转录因子STAT3磷酸化水平;采用实时荧光定量PCR法和ELISA法检测小鼠角膜再生上皮中IL-6的mRNA及蛋白水平.结果 角膜荧光素染色检查显示,正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠PBS注射组与IL-6注射组注射后24、48和72 h残留角膜上皮缺损面积占原始缺损面积的百分比随角膜上皮损伤后时间延长均明显缩小,同时间点IL-6注射组角膜上皮缺损面积均明显小于PBS注射组,组间总体差异均有统计学意义(正常对照组:F分组=19.982,P＜0.01;F时间=589.350,P＜0.01;糖尿病组:F分组=25.411,P＜0.01;F时间=334.807,P＜0.01).空白对照组及10、20、50、100 ng/ml IL-6处理组CFE分别为(13.23±1.12)％、(15.87±1.30)％、(21.69±1.62)％、(25.33±1.28)％和(18.67±1.54)％,随着IL-6质量浓度的增加CFE逐渐增加,总体比较差异有统计学意义(F=35.547,P＜0.01).50 ng/ml IL-6处理5、10、15、30和60 min细胞中△NP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量随着处理时间的延长均逐渐增加,各时间点细胞中△NP63、Ki67和p-STAT3蛋白的相对表达量均明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).糖尿病组和正常对照组小鼠角膜上皮刮除后24 h的再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量分别为0.45±0.21和1.00±0.16,糖尿病组小鼠角膜再生上皮中IL-6 mRNA相对表达量较正常对照组小鼠下降56％,差异有统计学意义(t=3.42,P=0.03),糖尿病小鼠角膜上皮刮除后48 h的再生上皮中IL-6蛋白质量浓度为(257±12)ng/μl,明显低于正常对照组小鼠的(323±17) ng/μl,差异有统计学意义(t=5.60,P＜0.01). 结论 IL-6能够通过激活STAT3信号通路促进正常和糖尿病小鼠角膜缘干细胞的活化和增生,进而促进角膜上皮修复,而封闭内源性IL-6则会延迟小鼠角膜上皮的修复.
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大剂量甲基强的松龙冲击治疗Stevens-Johnson综合征
目的 评价Stevens-Johnson综合征(SJS)早期应用大剂量甲基强的松龙冲击治疗的视力预后.方法 6例SJS患者,起病时均有假膜性结膜炎、结膜和(或)角膜上皮缺损.发病5 d内用甲基强的松龙 1 g/d静脉滴注,连用 3～4 d,局部用典必舒眼水、眼膏点眼至少1周,观察视力、角结膜及眼睑情况,随访1年.结果 经大剂量甲基强的松龙冲击治疗后,皮肤病变迅速得到改善,眼部炎症开始1～7 d继续加重,但角结膜上皮1个月内完全再生.慢性期所有眼的角膜透明,无伏格特栅栏(POV)破坏,表明角膜上皮干细胞完好无损,佳矫正视力均超过1.0,3眼有轻度浅层点状角膜病变,除1眼穹窿变浅外无瘢痕化情况.未出现激素所致的不良反应.结论 SJS急性期用大剂量甲基强的松龙冲击治疗,可以保护角膜上皮干细胞,防止角结膜的瘢痕化,从而改善SJS患者的视力预后.
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角膜上皮干细胞缺失动物模型的方法研究
目的:建立兔角膜上皮干细胞缺失动物模型,为人工生物角膜上皮实验研究奠定基础.方法:方法一,单纯去除角膜缘浅板层环周内外宽各2mm,深约100～150μm角膜组织;方法二,在方法一的基础上,再去除角膜中央浅板层组织约100～150μm.术后,裂隙灯显微镜下观察,以角膜混浊、上皮荧光素染色及新生血管为参数评价, 3项参数得分之和为该动物时间点总评分.以角膜新生血管评分在3分以上,角膜上皮混浊在2分以上,采用印迹细胞法角膜面取材行角蛋白K3单克隆抗体间接免疫荧光法检测表达为阴性的.结果:单纯去除角膜缘的动物模型10眼有4眼成功(40%),从制作至成功平均时间29.5±1.3d.角膜缘联合角膜中央板层组织共同去除组,10眼均成功(100%),从制作至成功平均时间为15.8±0.8d,两组成功率对比差异有统计学意义(χ2=8.58,P<0.01)功天数比较差异有统计学意义(t=24.5,P<0.01).两组成功模型角膜采用印迹细胞法取材行角蛋白K3单克隆抗体间接免疫荧光法检测表达均为阴性.结论:采用角膜缘联合角膜中央上皮共同去除法制备角膜上皮干细胞缺乏模型成功率高,周期短,值得推广应用.
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细胞周期依赖性激酶抑制剂P27,P21在人角膜上皮的表达研究
目的:探讨细胞周期依赖性激酶抑制剂(CKI)P27,P21在角膜上皮细胞的表达情况.方法:应用SP免疫组化法,检测P21,P27等细胞周期依赖性激酶抑制剂和增殖细胞核抗原(PCNA)在角膜上皮不同部位的表达情况.结果:角膜缘上皮区PCNA呈阳性表达,主要位于基底细胞层,中央区角膜上皮内未见阳性表达,差异有显著意义(P＜0.01);P27,P21在中央区角膜上皮内呈阳性表达,角膜缘上皮内未见阳性表达,差异均有显著意义(P＜0.01).结论:细胞周期依赖性激酶抑制剂P27,P21和PCNA在角膜上皮不同部位的表达差异,提示在角膜缘上皮基底层内存在着一群有较高的增殖能力,处于G1期的细胞群,即干细胞.
