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地塞米松对新生鼠高氧肺损伤肺组织甲状腺转录因子-1和表面活性蛋白C表达的影响
目的 探讨甲状腺转录因子-1(TTF-1)和表面活性蛋白C(SPC)在地塞米松干预新生鼠高氧肺损伤中的作用.方法 将3日龄新生SD大鼠随机分为高氧组(95%氧7 d)、高氧+地塞米松组(地塞米松组)和空气组.HE染色观察肺组织形态结构变化,并做辐射状肺泡计数(RAC).采用免疫组化法检测肺组织TTF-1和SPC表达.结果 (1)高氧组可见肺泡壁较薄、结构简单化、肺泡大小不均,有些肺泡融合、体积增大;地塞米松组除具有上述高氧组特征外,肺组织结构明显紊乱,部分肺泡壁及间隔破坏;高氧组和地塞米松组RAC值分别为(9.50±1.05)、(10.03±3.26),较空气组(13.00±1.79)减少,差异均有显著性(P＜0.05).(2)空气组TTF-1阳性显色细胞分布在肺间隔和肺泡壁Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ),无扩张肺组织处也有阳性细胞,各级支气管及小血管部位未见阳性显色.高氧组较空气组表达减少,散在分布于肺泡壁、肺间隔增厚部位及脱落于肺泡腔的AECⅡ;地塞米松组较空气组明显增强,变薄及扩张的肺泡壁也有阳性显色.空气组、高氧组、地塞米松组TTF-1表达积分分别为(1.32±0.55)、(0.96±0.67)、(1.76±0.69),高氧组较地塞米松组和空气组明显减少,差异有显著性(P均＜0.05);而地塞米松组较空气组明显增高,差异有显著性(P＜0.05).(3)SPC阳性显色主要在肺间隔和肺泡壁AECⅡ,支气管黏膜上皮细胞也可见弱阳性表达,但存在个体差异,有些标本整个切片未见表达.高氧组、地塞米松组和空气组SPC表达积分差异无显著性,分别为(1.58±0.49)、(1.52±0.50)、(1.66±0.48),P＞0.05.结论 (1)SPC不仅在AECⅡ表达,也表达在支气管黏膜上皮细胞;在高氧肺损伤及地塞米松干预肺组织SPC表达变化不大,有可能是AECⅡ增殖、分化不足的反映.(2)高氧肺损伤组织TTF-1表达减少,地塞米松可使TTF-1表达增强,加重肺部病理改变.
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高氧致慢性肺疾病新生大鼠肺泡损伤及肺泡上皮细胞的变化
目的 探讨高浓度氧致新生鼠肺损伤时肺泡形态学变化和肺泡上皮细胞动态变化.方法 通过吸入85%～90%高浓度氧气建立新生鼠慢性肺疾病组织模型.80只新生鼠分为实验组和对照组,实验组(n=40)吸人85%～90%氧气,对照组(n=40)吸入空气.分别留取1、3、7、14、21 d的肺组织,应用放射状肺泡计数(RAC)并且测量肺泡间隔厚度以判定肺泡发育情况,应用免疫组化及RT-PCR技术测定肺组织表面活性蛋白C(SPC)、水通道蛋白-5(AQP5)蛋白及mRNA表达.结果 在生后1 d和3 d,两组RAC和肺泡间隔厚度差异无显著性(P>0.05).在7 d和14 d,实验组的RAC明显低于对照组(P<0.01),肺泡间隔厚度高于对照组(P<0.01),21 d时肺泡间隔厚度升至高,与对照组间比较差异有显著性(10.62±5.01 vs 3.62±0.88,P<0.001),RAC降至低,与对照组间比较差异有显著性(3.57±1.24 vs10.47±0.88,P<0.001).高氧肺损伤实验组SPC 3 d时表达明显减少,7d后开始增多,14 d、21d明显高于对照组;而AQP5随着肺损伤的加重表达进行性下降.结论 高氧肺损伤可导致肺泡发育停滞,明显损伤肺泡上皮细胞,肺泡上皮细胞特异性标志物SPC、AQP5表达结果提示I型肺泡上皮细胞损伤严重,Ⅱ型肺泡上皮细胞虽然数量有所增加但其分化与转化能力明显下降.
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黄曲霉毒素G1对体外原代培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响
目的 进一步研究黄曲霉毒素G1(AFG1)对可能作用的靶细胞SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)损伤的生物学作用.方法 以酶消化法原代培养SD大鼠AT-Ⅱ,纯化后培养36 h,分别给予不同浓度(0.5,1.0 和2.0 mg·L-1)的AFG1处理.AFG1作用24 h后,收集细胞和培养基上清液及细胞爬片,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率、生物化学方法检测细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(AKP)活力、透射电镜方法观察AT-Ⅱ超微结构的改变、激光扫描共聚焦显微镜(CLSM )检测Fluo-3/AM负载细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)、免疫细胞化学、CLSM及流式细胞术(FCM)方法检测AT-Ⅱ特异分化标志物肺表面分泌蛋白C(SP-C )表达情况.结果 给予不同浓度AFG1处理后,体外培养AT-Ⅱ细胞存活率分别为(88±3)%,(80±9)%和(72±8)%,明显低于溶剂对照组(101±2)%(n=6,P＜0.01);培养上清液中LDH和AKP活力明显增高;透射电镜观察可见上皮细胞板层小体出现空化,线粒体肿胀、空泡化等损伤性变化.CLSM结果显示,AFG1 0.5,1.0 和2.0 mg·L-1处理组,AT-Ⅱ细胞内平均钙离子荧光强度分别为200±21,225±14和229±12,明显高于溶剂对照组161±28 (n=6,P＜0.01) ,有明显浓度依赖关系(r=0.849);免疫细胞化学、CLSM及FCM检测结果显示AFG1处理组AT-Ⅱ SP-C蛋白表达明显低于溶剂对照组.结论 AFG1对体外培养的大鼠AT-Ⅱ具有明显致损伤作用,同时增加细胞[Ca2+]i、降低SP-C蛋白的表达.
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体外诱导人骨髓间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化
背景:Ⅱ型肺泡上皮细胞被证明在大鼠肺纤维化模型中直接参与肺的修复并可以减轻肺纤维化的程度.胚胎干细胞可以在体外诱导分化Ⅱ型肺泡上皮细胞,但是其应用受到多方面的限制.目的:探讨体外诱导骨髓间充质干细胞为Ⅱ型肺泡上皮细胞的方法及转化率.方法:取人胸骨骨髓细胞,体外分离培养骨髓间充质干细胞.采用无血清小气道生长液和改良无血清小气道生长液作为培养液,将骨髓间充质干细胞与人胚肺间质细胞共培养.观察骨髓间充质干细胞形态并用反转录PCR 检测表面活性蛋白C 的mRNA 以及免疫荧光检测表面活性蛋白C 表达.结果与结论:骨髓间充质干细胞与人胚肺间质细胞共培养10 d 后开始出现部分骨髓间充质干细胞由原先的长梭形变成和上皮细胞相似的形态.15d 后开始检测到表面活性蛋白C mRNA,但未随共培养时间延长而有所增加.改良无血清小气道生长液与无血清小气道生长液相比能增加表面活性蛋白C mRNA 表达(P < 0.05).说明采用无血清小气道生长液或改良无血清小气道生长液,并与胚肺间质细胞共培养可以将骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞,但其转化率较低,表面活性蛋白C 的阳性率仅为(3.15±0.69)%.
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人肺腺癌干细胞表型与预后的相关性
背景：肺腺癌干细胞是肺腺癌确诊的重要实验室依据，但其评估患者预后的价值如何，临床尚未定论。目的：探讨人肺腺癌干细胞表型与患者预后的关系。方法：选取2010年2月至2013年1月在新疆医科大学第一附属医院治疗的肺腺癌患者48例，采用免疫荧光法检测患者肺腺癌干细胞表型标志，比较不同表型与患者临床病例特征以及患者预后的关系。结果与结论：48例肺腺癌组织中均观察到SP-C表达和CCSP表达，具有肺细支气管肺泡干细胞的表型特征，其中34例同时表达OCT4(OCT4+支气管肺泡干细胞组)，14例不表达OCT4(OCT4-支气管肺泡干细胞组)。OCT4+支气管肺泡干细胞组和OCT4-支气管肺泡干细胞组肺腺癌患者的年龄、性别、吸烟史以及肿瘤分期差异无显著性意义(P >0.05)；OCT4+支气管肺泡干细胞组有23例(68%)患者癌细胞转移，明显高于OCT4-支气管肺泡干细胞组(21%)，差异有显著性意义(P <0.05)；在腺癌患者年龄、性别、吸烟史、分期以及癌细胞转移等临床病理特征分层中，OCT4-支气管肺泡干细胞组肺腺癌2年生存率普遍高于OCT4+支气管肺泡干细胞组，两组生存曲线差异有显著性意义(P <0.05)。结果表明人肺腺癌干细胞具有肺细支气管肺泡干细胞表型特征，同时表达胚胎干细胞基因OCT4时，患者预后差，与肺腺癌转移有关。
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高氧对早产大鼠肺表面活性蛋白C表达的影响
目的 探讨高氧对早产大鼠肺表面活性蛋白C(SP-C)表达的影响.方法 孕21 d SD早产大鼠,生后12～24 h内随机分为空气组、高氧组.于空气或高氧暴露后1、4、7、10和14 d提取肺组织,采用RT-PCR测定SP-C mRNA表达,免疫组化和Western-blot检测SP-C蛋白表达.结果 早产大鼠生后肺组织SP-C表达1 d时高,4 d后表达渐减弱,其阳性染色信号主要定位于Ⅱ型肺泡上皮细胞.高氧暴露1 d,肺组织SP-CmRNA及蛋白表达显著低于空气组,以后增加,高氧7 d增加明显,高氧14 d时SP-C表达较空气组又减弱.结论 SP-C参与了早产大鼠肺发育及高氧肺损伤的生理与病理过程,高氧暴露导致SP-C表达下调或功能障碍是促使高氧肺损伤发生发展的重要因素.
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SFTPC突变致儿童间质性肺病伴家系外显不全3例并文献复习
目的 报告3例肺表面活性蛋白C基因(SFTPC)突变致儿童间质性肺病(chILD)伴家系外显不全的临床特征及基因突变特点.方法 总结3例家系外显不全的chILD临床资料和基因检测结果,对SFTPC突变基因型及其临床表型进行文献复习.结果 3例患儿均为足月顺产,出生时无异常,在生后2～15月出现咳嗽、气促和发绀,持续不能离氧,CT示弥漫磨玻璃样变伴或不伴囊性变,其中1例有家族史.多予机械通气、肺表面活性物质、类固醇、羟氯喹治疗,2例好转,1例死亡.3例患儿家系测序均检测到SFTPC基因存在致病性杂合错义突变[2例c.218T>C(p.I73T)杂合错义突变,为国外数据库常见致病突变;1例c.314A>G(p.D105G)杂合错义突变],各家系均有健康携带者.共检索到报道SFTPC突变致chILD外显不全的文献7篇10例患儿,结合本文3例,13例起病时间从新生儿期至11岁,CT多表现为弥漫性磨玻璃样变,均有长期吸氧史,2例死亡,2例chILD,9例缓解.结论 SFTPC突变致chILD在中国汉族人群存在外显不全现象,对这类疾病的临床特点及基因检测结果的认识为早期诊断、干预、预后判断和遗传咨询提供了依据.
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硫酸羟氯喹治疗肺表面活性蛋白C基因突变致婴儿间质性肺病1例并文献复习
目的 报道硫酸羟氯喹治疗肺表面活性蛋白C基因(SFTPC)突变致婴儿间质性肺病的疗效,提高对该病诊断和治疗的认识.方法 总结分析1例SFTPC突变致婴儿间质性肺病的临床特点、诊断过程和硫酸羟氯喹的疗效,并进行文献复习.结果 患儿女,2月龄,因"生后反复咳嗽伴气促2个月"于2015年9月9日就诊.患儿在新生儿期即发生呼吸窘迫,持续无法离氧.影像学示肺部渗出,病原学检查均阴性,常规抗感染治疗无效,否认肺部疾病家族史.基因检测发现SFTPC基因外显子4有1个杂合错义突变位点(c.T337C:p.Y113H),目前尚无报道.患儿13月龄时开始硫酸羟氯喹治疗,治疗6个月后,呼吸窘迫、生长发育情况和胸部CT影像学表现明显改善.在PubMed、Web of Science、中国知网、维普数据库和万方数据库中检索SFTPC基因突变的间质性肺病,检索时间均从建库至2016年12月1日,共检索到相关文献12篇,均为英文文献.总结包括本文1例患儿在内的51例SFTPC基因突变致间质性肺病病例使用硫酸羟氯喹的治疗情况,随访0.3~15.8年,其中单用硫酸羟氯喹治疗的有12例,均取得良好疗效,未提及或未发现药物不良反应;全身糖皮质激素合用硫酸羟氯喹治疗39例,33例(84.6%)有效,2例(5.1%)无改善,4例(10.3%)恶化(1例死亡).结论 对于SFTPC基因突变的婴儿间质性肺病,早期发现和早期诊断很重要,及早使用硫酸羟氯喹治疗可以改善临床症状、体征和生长发育情况,减少终末肺的发生.
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肺表面活性蛋白C基因突变相关性新生儿呼吸窘迫综合征2例并文献复习
目的 总结2例肺表面活性蛋白C基因(SFTPC)突变的新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)的临床特点和基因诊断,提高对该病的认识.方法 总结分析本文2例NRDS患儿的临床资料和基因检测结果,并进行文献复习.结果 2例患儿分别为38+3周足月儿和35+2周早产儿,均于生后即发生呼吸窘迫,X线胸片示NRDS,病原学检查均为阴性.均否认肺部疾病家族史.表面活性物质替代治疗和正压辅助通气支持有效.基因检测显示:1例为SFTPC基因c.68G＞ G/A,p.R23Q杂合错义突变,为首次报道;1例为SFTPC基因c.115G＞ G/T,p.V39L杂合错义突变,为已报道致病突变.共检索到临床资料完整的SFTPC突变NRDS 6篇文献7例,结合本文2例,9例均生后呼吸窘迫,影像学以弥漫性侵润和间质性改变为主,多予机械通气、PS对症支持治疗,2例死亡,1例间质性肺病,1例支气管肺发育不良,4例随访健康,1例失访.结论 中国NRDS病例中存在SFTPC基因突变,相关基因突变的识别,可为早期干预、预后判断以及遗传咨询提供依据.
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子痫前期对胎鼠肺成熟的影响及其机制研究
目的 探讨子痫前期对胎鼠肺成熟的影响及其机制.方法 将孕鼠分为子痫前期早产组(preeclampsia preterm group,PPG)、非子痫前期足月产对照组(non-preeclampsia fullterm group,NPFG)与非子痫前期早产对照组(non-preeclampsia preterm group,NPPG),使用N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)建立子痫前期动物模型,无菌操作取出胎鼠肺,每组随机取胎肺用于组织切片,进行苏木精-伊红染色,镜下观察胎鼠肺气管及肺泡的发育情况;应用实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)及Western blot技术检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、表面活性蛋白B(SP-B)及表面活性蛋白C(SP-C)mRNA及蛋白水平的表达情况.结果 组织切片染色显示子痫前期早产组胎肺血管及气管发育相对于非子痫前期早产对照组更好;组织Real-time PCR及Western blot检测结果 显示:非子痫前期足月产对照组HIF-1α、VEGF、SP-B与SP-C mRNA及蛋白表达水平明显高于非子痫前期早产对照组及子痫前期早产组,差异有统计学意义(均P＜0.05);子痫前期早产组HIF-1α与VEGF mRNA及蛋白表达水平比非子痫前期早产对照组升高,差异有统计学意义(均P＜0.05);子痫前期早产组SP-C 与SP-B mRNA及蛋白表达水平与非子痫前期早产对照组差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 子痫前期能促进胎肺的结构成熟,但对肺泡功能无明显影响.
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染矽尘大鼠肺泡上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化研究
目的 观察染矽尘大鼠肺泡上皮细胞(AEC)能否诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化为AEC.方法 随机取6只无特定病原体级健康雄性SD大鼠,以全骨髓贴壁法培养BMMSCs.随机取同批大鼠6只,其中3只以1.0 mL质量浓度为40 g/L的矽尘混悬液一次性气管内注入制作染矽尘模型,另3只注入0.9%氯化钠溶液1.0 mL,上述2种大鼠均采用免疫粘附纯化法培养AEC.设置实验组(BMMSCs与染矽尘大鼠AEC共培养)、对照A组(BMMSCs和正常大鼠AEC共培养)和对照B组(BMMSCs单独培养),于共培养第4和8天,以倒置显微镜观察各组BMMSCs形态变化,对BMMSCs进行水通道蛋白5(AQP5)和表面活性蛋白C(SP-C)免疫荧光双重染色,分别采用倒置荧光显微镜(IFM)和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察其荧光表达,采用Image-pro plus 6.0图像分析软件分析2种蛋白的荧光积分光密度(IOD).结果 细胞共培养后,实验组和对照A组的BMMSCs逐渐从长梭形向立方形和多边形转化,第8天时变化较第4天更明显,对照A组BMMSCs形态变化无实验组明显,对照B组BMMSCs的形态无明显变化.IFM和LSCM下,在共培养第4和8天,实验组、对照A组BMMSCs均可见呈绿色荧光的AQP5和红色荧光的SP-C表达,对照B组BMMSCs均可见少量AQP5绿色荧光表达,均无SP-C红色荧光表达.2种显微镜下均观察到,于共培养第4和8天,实验组BMMSCs的2种蛋白荧光IOD值均较同时间点对照A组和对照B组增强(P<0.01),对照A组BMMSCs的2种蛋白荧光IOD值均较同时间点对照B组增强(P<0.01);实验组和对照A组BMMSCs在共培养第8天时间点2种蛋白的荧光IOD值均较同组第4天时间点增强(P<0.01).结论 染矽尘大鼠AEC能有效诱导BMMSCs分化成AEC.
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高氧暴露对新生大鼠肺SP-C表达的影响
目的 探讨高氧暴露对新生大鼠肺组织表面活性蛋白C(SP-c)表达的影响.方法 将新生的72只SD大鼠随机分为空气组、高氧组,每组36只.每组又分为3、7、14d三个亚组.于空气或高氧暴露后3、7、14d取肺组织,采用免疫组化方法观察肺组织中SP-C表达的变化.结果 高氧组3d SP-C表达强度较空气组增强(P＜0.05),高氧组7dSP-C表达强度与空气组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),高氧组14d SP-C表达强度较空气组减弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 高氧暴露可导致新生大鼠肺SP-C表达减弱或功能缺失,SP-C表达异常可能是高氧肺损伤的重要因素.
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不同吸入氧分数对原代胎鼠AECⅡ的损伤作用
目的 探讨不同吸入氧分数(FiO2)对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)的损伤作用.方法 原代分离培养孕21d足月胎鼠AECⅡ,随机分为3组: (1)FiO20.21组(Ⅰ组):将细胞置于37℃含5%=氧化碳的培养箱培养24h, (2)FiO20.40组(Ⅱ组):将6孔板中的细胞放入氧仓,通入40%氧后置于孵箱培养24h, (3)FiO20.75组(Ⅲ组):向氧仓通入75%氧后,置于孵箱培养24h,采用分光光度计测定各组细胞上清夜中丙二醛(MDA),乳酸脱氢酶(LDH),碱性磷酸酶(AKP)浓度,流式细胞术检测细胞凋亡率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定表面活性蛋白C(SPC)mRNA的表达.结果 Ⅲ组细胞上清夜中MDA,LDH,AKP浓度及细胞凋亡率均显著高于Ⅱ组及Ⅰ组(P<0.01),Ⅰ组和Ⅱ组之间四项指标无显著性差异(P>0.05).Ⅲ组细胞的SPC mRNA表达水平明显高于Ⅱ组,而Ⅱ组又高于Ⅰ组,3组之间差异有显著性(P<0.01).结论 75%氧暴露24h可导致AECⅡ损伤,功能受损,而40%氧对AECⅡ氧化损伤作用不明显,但仍可减弱AECⅡ SPC mRNA的表达.
