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Salubrinal通过抑制内质网应激诱发的细胞凋亡改善心力衰竭大鼠心功能
目的 探讨特异性真核翻译起始因子2α(eIF2α)去磷酸化抑制剂Salubrinal (Sal)对缺血诱发的心力衰竭(心衰)大鼠心功能的影响及其机制.方法 8周龄雄性Sprague-Dawley(SD)清洁级大鼠,经冠状动脉结扎建立心肌梗死引起的心衰模型,然后对大鼠称重并进行编号,根据随机数字表分为4组,即假手术组(n=12)、心衰组(n=10)、溶剂对照组(DMSO组,n=12)和Sal处理组(Sal组,n=12).分别于术后30 min和8周采用超声心动图检测各组大鼠心功能指标,术后30 min超声心动图检查示左心室短轴缩短率(LVFS) ＜30％标志模型建立成功.8周末处死大鼠后测定左心室质量指数,采用Annexin Ⅴ-PI染色流式细胞技术检测心肌细胞凋亡率,分别采用免疫组织化学法和实时逆转录聚合酶链反应检测心肌细胞内质网应激标志蛋白和mRNA的表达水平.结果 (1)各组大鼠心功能的检测结果:药物干预8周后,心衰组大鼠左心室收缩末期内径(LVESD)和左心室舒张末期内径(LVEDD)均明显高于假手术组(P分别为0.032和0.021),左心室射血分数(LVEF)明显低于假手术组(P=0.028).Sal组大鼠LVESD和LVEDD均明显低于心衰组和DMSO组(P分别为0.031和0.035),LVEF则明显高于心衰组和DMSO组(P分别为0.029和0.036).(2)各组大鼠左心室质量指数的检测结果:药物干预8周后,心衰组大鼠左心室质量指数明显大于假手术组[(2.30 ±0.40) mg/g比(1.78 ±0.31) mg/g,P＜0.05],Sal组则明显小于心衰组和DMSO组[(1.88±0.25) mg/g比(2.30±0.40)和(2.25±0.36) mg/g,P均＜0.05].(3)各组大鼠心肌细胞凋亡的检测结果:药物干预8周后,心衰组大鼠心肌细胞凋亡率明显高于假手术组[(32.8±3.9)％比(5.5±0.6)％,P=0.041],Sal组明显低于心衰组和DMSO组[(10.3±1.2)％比(32.8±3.9)％和(30.4±3.1)％,P分别为0.029和0.045].(4)各组大鼠心肌组织中内质网应激相关蛋白表达的检测结果:药物干预8周后,心衰组大鼠心肌细胞中B型利钠肽(BNP)、钙网蛋白(CRT)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)和半胱氨酸蛋白酶12(caspase-12)的蛋白表达水平均明显高于假手术组(P均＜0.05),Sal组均明显低于心衰组和DMSO组(P均＜0.05).(5)各组大鼠心肌组织中内质网应激相关蛋白mRNA表达水平的检测结果:药物干预8周后,心衰组大鼠心肌细胞中BNP、CRT和caspase-12的mRNA表达水平均明显高于假手术组(P均＜0.05),Sal组均明显低于心衰组和DMSO组(P均＜0.05).结论 Sal可通过抑制内质网应激反应介导的凋亡信号通路分子caspase-12的表达抑制心肌细胞凋亡,从而改善心衰大鼠的心功能.
关键词： 心力衰竭 充血性 细胞凋亡 Salubrinal -
选择性磷酸酶抑制剂Salubrinal对急性百草枯中毒大鼠肺组织细胞自噬和凋亡的影响
目的 观察选择性磷酸酶抑制剂Salubrinal治疗对急性百草枯(PQ)中毒大鼠肺组织细胞自噬和凋亡的影响,并探讨其治疗机制.方法 将200只Wistar大鼠按计算机生成的随机排列表分为4组,每组50只.一次性灌胃40 mg/kg PQ溶液1 mL制备PQ染毒模型,之后每日1次腹腔注射1 mL生理盐水(NS);对照组一次性给予1 mL NS灌胃,之后每日2次腹腔注射1 mL NS;Sal 0.5和Sal 1.0组分别于PQ染毒后1、3、5d腹腔注射0.5 mg/kg或1.0 mg/kg Salubrinal 1 mL,每日1次.染毒后7d取肺组织,苏木素-伊红(HE)染色后观察肺组织形态学改变;免疫组化染色观察肺组织自噬相关蛋白LC3-Ⅱ阳性表达;蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测肺组织LC3-Ⅱ和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白表达.结果 HE染色结果显示:PQ染毒组肺组织结构部分破坏,肺泡壁塌陷,肺泡腔扩大,局部炎性细胞浸润,肺泡隔显著增厚,局部明显出血;Sal 0.5组和Sal 1.0组肺组织病理改变较PQ染毒组明显减轻.免疫组化染色显示:与对照组比较,PQ染毒组、Sal 0.5组和Sal 1.0组肺组织LC3-Ⅱ阳性表达均明显降低(A值:78.34±10.71、76.52±8.21、77.48±9.11比117.58±15.26,均P＜0.05);而后3组间两两比较差异无统计学意义(均P＞0.05).Western Blot结果显示,与对照组比较,PQ染毒组肺组织LC3-Ⅱ、caspase-3蛋白表达均明显升高[LC3-Ⅱ(A值):0.22±0.05比0.14±0.03,caspase-3(A值):0.115 ±0.013比0.023±0.006,均P＜0.05].与PQ染毒组比较,Sal 0.5组和Sal 1.0组肺组织LC3-Ⅱ、caspase-3蛋白表达均明显降低[LC3-Ⅱ(A值):0.19±0.05、0.18±0.04比0.22±0.05,caspase-3(A值):0.078±0.012、0.076±0.010比0.115±0.013,均P＜0.05].结论 急性PQ中毒大鼠肺组织发生了内质网应激-自噬;Salubrinal可降低急性PQ中毒大鼠肺组织发生细胞自噬,抗细胞凋亡,从而起到治疗作用.
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Salubrinal通过调节破骨细胞发育改善骨关节炎胫骨平台不均匀沉降
目的 观察Salubrinal对早期骨关节炎(OA)小鼠胫骨平台不均匀沉降的治疗作用.方法 30只小鼠随机分为对照(Sham)组、OA组和OA+Salubrinal(OA+Sal)组.采用手术切除小鼠膝关节内侧半月板建立OA模型,Sham组只切开关节内侧皮肤;OA+Sal组小鼠皮下注射Salubrinal(1 mg/kg)2周,Sham组及OA组给予等量的生理盐水.采用番红O和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,观察胫骨平台内侧和外侧的组织形态学改变以及破骨细胞活性变化.使用骨髓细胞的破骨细胞形成、迁移、黏附实验检测破骨细胞发育情况.结果 与Sham组相比,OA组破骨细胞发育显著激活,软骨下骨的破骨细胞活性也明显增高;关节软骨OARSI评分、钙化软骨比例(CC/TAC)均显著升高(P＜0.05);胫骨平台内侧软骨下骨的骨面积分数(B.Ar/T.Ar)明显增加(P＜0.05),但外侧B.Ar/T.Ar、软骨下骨板(SBP)厚度均显著降低(P＜0.05).与OA组相比,OA+Sal组破骨细胞发育及软骨下骨破骨细胞活性被抑制,OARSI评分、CC/TAC均有所降低(P＜0.05);而且,内外侧胫骨平台软骨下骨B.Ar/T.Ar和SBP厚度的不均匀改变均明显恢复(P＜0.05).结论 Salubrinal通过调控破骨细胞发育对早期OA胫骨平台的骨重建和不均匀沉降有明显的改善作用.
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Salubrinal通过抗氧化应激延缓细胞衰老的实验研究
目的：观察Salubrinal对Etoposide诱导的大鼠肾小管上皮细胞（ NRK-52E）衰老的保护作用，并探讨其可能的作用机制。方法将NRK-52E细胞株分为对照组、衰老组（ Etoposide 1μg／ml诱导）及治疗组（ Eto-poside 1μg／ml＋Salubrinal 50μmol／L），药物干预24 h后于倒置显微镜下观察各组NRK-52E细胞形态，β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）染色方法检测细胞衰老情况，荧光素酶报告基因法检测p16启动子活性，DCFH法检测ROS的水平， Western blot法检测氧化应激标志性蛋白c-fos表达水平。结果与对照组相比，Etoposide刺激24 h后NRK-52E细胞衰老明显增加，Salubrinal干预后NRK-52E细胞衰老形态改善；Etoposide刺激后活性氧（ ROS）产生增多， p16启动子活性增强，c-fos表达增加，Salubrinal干预后上述现象均被逆转。结论 Salubrinal可能通过抗氧化应激延缓Etoposide诱导的NRK-52E细胞衰老。
关键词： Salubrinal 衰老 氧化应激 保护 -
Salubrinal对高糖高脂饲料诱导的妊娠期糖尿病小鼠的作用
目的:探讨Salubrinal对高糖高脂饲料诱导的妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)小鼠能量摄入量、体重、血糖、胰岛素和胰岛形态学变化的影响.方法:C57BL/6J雌性小鼠随机分为:正常对照组(C组)、GDM模型组(G组)和GDM Salubrinal干预组(G+S组);多个时间点测量小鼠能量摄入量、体重和血糖水平;孕第10天收集血液测定胰岛素水平,计算胰岛β细胞功能指数(HOMA-B)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);孕第17天处死小鼠,进行胰岛形态学观察.结果:G组、G+S组在多个时间点能量摄入量和体重均大于C组;而G组和G+S组之间的差异不大.在交配前和孕第10天,血糖水平均表现为G+S组＞G组＞C组;在孕第17天,3组之间差异不大.在孕第10天,3组的胰岛素水平差异不大,但HOMA-B值表现为G+S组＜G组＜C组,HOMA-IR值表现为G+S组＞G组＞C组胰岛形态学检查发现,C组胰岛形态和胰岛β细胞超微结构较正常;G组和G+S组胰岛数量均增多,胰岛增生和萎缩同时存在,胰岛β细胞超微结构异常,线粒体严重肿胀,粗面内质网高度膨胀.结论:Salubrinal对高糖高脂饲料诱导的GDM小鼠不具有防治潜力.
关键词： Salubrinal 妊娠期糖尿病 胰岛β细胞 高糖高脂饲料 小鼠 -
内质网应激调节肝星状细胞HGF表达的作用机制
目的:探讨内质网应激对肝星状细胞分泌肝细胞生长因子(hypatocyte growth factor,HGF)的影响及其可能机制.方法:通过在培养的大鼠肝星状细胞T6中分别加入5.0μg/mL衣霉素或0.2μmol/L毒胡萝卜素建立肝星状细胞内质网应激模型,4.0 mmol/L 4-苯基丁酸钠(4-phenylbutyrate,4-PBA)和200.0 μmol/L salubrinal作为内质网应激抑制剂对T6细胞进行预处理,重组慢病毒LV-eIf2α-shRNA-GFP敲减T6细胞中的eIf2α mRNA表达,并提取mRNA和全蛋白进行RT-PCR和Western blot实验检测HGF、分子伴侣重链结合蛋白(glucose-regulated protein 78,GRP78)、真核翻译起始因子2α (eukaryotic translation initiation factor 2α,eIf2α)、磷酸化eIf2α、激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)以及凋亡信号分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP).结果:衣霉素、毒胡萝卜素可诱导T6细胞GRP78升高,激活内质网应激状态的同时抑制HGF表达,4-PBA和salubrinal可阻止内质网应激引起的HGF降低,但对ATF4和CHOP的表达作用不同.慢病毒转染T6降低细胞eIf2α表达的同时成比例降低HGF表达.结论:ERS激活后可通过影响eIf2α表达从而抑制HGF表达.
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内质网应激干预与神经系统疾病治疗前景
内环境稳定是内质网生理功能实现的基础,氧化应激反应、同型半胱氨酸增加、Ca2+稳态失衡引发内质网应激(ERS).ERS包括未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应、胆固醇调节级联反应.目前发现经内质网途径引发的细胞凋亡与多种疾病的发生发展均存在关系.近年来,ERS途径引发细胞凋亡成为医学科研热点,研究ERS、细胞凋亡可以为疾病治疗提供新的思路.
关键词： 内质网应激 干预 细胞凋亡 衣霉素 Salubrinal -
Salubrinal对大鼠脑缺血再灌注模型LC3-ⅡmRNA及LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA的影响
目的 探讨Salubrinal对大鼠脑缺血再灌注模型LC3-ⅡmRNA及LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA表达的影响.方法 用线栓法建立大鼠大脑中动脉脑缺血(MCAO)缺血再灌注模型.大鼠随机分为假手术组、模型组、Salubrinal组(Sal组),各组又分为再灌6、12、24、72 h 4个亚组.各组于再灌相应时间点行神经功能缺损评分,并断头取脑行HE染色及Real time-PCR检测.结果 神经功能缺损:与假手术组比较,模型组、Sal组各时间点均有神经功能缺损(P<0.01);与模型组比较,再灌24、72 h Sal组神经功能缺损评分降低(P<0.05).HE染色:模型组神经元减少、缺失,细胞肿胀,部分破裂,细胞核固缩、偏移、深染,胶质细胞增生,经Salubrinal干预后,再灌各时间点神经元增多,胞膜较完整,核固缩现象较轻,水肿轻微.Real time-PCR检测:与假手术组比较,模型组、Sal组各指标于再灌各时间点均增高(P<0.01).与模型组比,Sal组LC3-ⅡmRNA表达于再灌12、24、72 h下降明显(P<0.05);Sal组LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA于再灌后各时间点下降均明显(P<0.01).结论 Salubrinal通过下调LC3-ⅡmRNA及LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA比值,对大鼠脑缺血再灌注损伤起保护作用.
