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siRNA沉默TPX2基因对食管癌细胞EC9706的增殖和TPX2基因表达的影响
目的:研究TPX2基因特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)对食管鳞癌EC9706细胞基因表达的抑制作用及对食管癌细胞生长的影响.方法:以食管鳞癌EC9706细胞为研究对象,利用Lipofectamine2000介导TPX2 siRNA分组转染EC9706细胞24,48,72,96 h(实验组),并设立阴性对照组和空白对照组.RT-PCR检测siRNA转染前后TPX2 mRNA的表达水平的变化:Western blot检测转染前后EC9706细胞中TPX2蛋白表达水平的变化;MTT法检测瞬时转染TPX2 siRNA对EC9706细胞增殖的影响.结果:导入有效siRNA后,PT-PCR及Western blot结果显示.TPX2 siRNA可使EC9706细胞中TPX2 mRNA水平及蛋白表达水平下降,至72 h时表达量低,与空白对照组相比分别为0.31±0.08和0.39±0.12,差异有统计学意义(P<0.05);MTT实验显示细胞的生长增殖受到明显抑制,与对照组相比抑制率可达35.4%(P<0.05).结论:siRNA可以有效抑制EC9706细胞中TPX2的表达,并降低EC9706细胞的增殖能力.
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人TPX2基因过表达慢病毒质粒的构建及其人宫颈癌细胞稳定表达株的筛选
目的 构建人TPX2基因过表达慢病毒质粒,并筛选该基因的人宫颈癌HeLa细胞稳定表达株.方法 经PCR法扩增人TPX2基因序列,克隆至线性化的慢病毒载体LV11中,构建重组慢病毒质粒,进行酶切及测序鉴定.将鉴定正确的重组慢病毒及空载体LV11(LV 11-NC)分别与辅助质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并检测病毒滴度.用重组慢病毒感染HeLa细胞,经不同浓度G418(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.O、1.2、1.5、2.0 mg/ml)筛选TPX2基因过表达稳转细胞株,同时设阴性对照(感染LV 11-NC慢病毒)及空白对照(未感染病毒).采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测各组HeLa细胞中TPX2基因mRNA转录及蛋白的表达水平.结果 经酶切及测序鉴定证明重组慢病毒质粒构建成功.经293T细胞包装后,获得重组慢病毒的滴度为3×108 TU/ml.采用0.6 mg/ml G418成功筛选出TPX2过表达细胞株.与阴性对照及空白对照比较,感染重组慢病毒的HeLa细胞中,TPX2基因mRNA转录及蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05).结论 成功构建了人TPX2过表达慢病毒质粒,并筛选出TPX2稳定表达的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础.
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TPX2基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响
目的 探讨TPX2基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 构建3个靶向TPX2基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒,转染A549细胞,RT-PCR检测TPX2基因mRNA的转录水平;筛选干扰效果佳的质粒转染的细胞,RT-PCR检测增殖相关基因CDK4和CyclingD1 mRNA的转录水平,Western blot检测TPX2蛋白的表达水平,显微镜下观察细胞的生长情况,MTT法检测细胞的增殖活力.结果 TPX2 shRNA-3质粒干扰效果佳,有效沉默TPX2基因后,A549细胞中TPX2基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均受到明显抑制(P＜0.01),与空白对照组比较,抑制率分别为73.8％和82.8％;CDK4和CyclingD1基因mRNA的转录水平也明显降低(P＜0.01或＜0.05),与空白对照组比较,抑制率分别为76.7％和67.3％;A549细胞的生长和增殖也明显受到抑制,转染后72 h,增殖抑制率可达61.55％(P＜0.05).结论 成功构建了靶向TPX2基因的shRNA表达质粒,其在mRNA和蛋白水平有效抑制A549细胞TPX2基因的表达后,细胞生长受到抑制,增殖能力减弱.
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TPX2基因在乳腺癌病理进展和放疗中作用机制研究
目的 研究TPX22基因对乳腺癌病理进程和放疗的影响及作用机制.方法 建立乳腺肿瘤干细胞裸鼠移植瘤模型,根据是否接受细胞放射干预分为干预组和未干预组,采用免疫组化法检测两组乳腺癌细胞裸鼠模型接受放疗干预前后TPX22基因蛋白表达水平,并检测TPX2相关靶基因(Bcl-2、Bax、p21及p53)在乳腺癌组织中的蛋白表达,分析TPX2与其相关靶基因蛋白的相关性.结果 两组乳腺肿瘤裸鼠模型右腋下均有显著移植瘤生长,肿瘤组织与周围正常组织分解清晰,移植瘤组织内有大量肿瘤细胞弥漫性分布,肿瘤细胞形态不规则.干预组接受放疗后TPX2阳性率50％,对照组87.5％.TPX2与Bcl-2表达水平呈显著正相关性(RBcl-2=0.9688),与Bax、p21及p53呈显著负相关性(RBax=-0.9675、Rp21=-0.9563、RP53=-0.9742).结论 TPX2在乳腺癌细胞中呈高表达,可能通过调控Bcl-2、Bax、p21及p53等相关靶基因表达水平,参与疾病进展,影响放疗效果,TPX2有望成为乳腺癌治疗的新靶点.
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TPX2基因在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖凋亡的影响和机制研究
目的 探讨Xklp2靶蛋白(TPX2)基因在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖凋亡的影响和机制.方法 RT-PCR及Westernblotting检测胃癌组织及癌旁组织中TPX2 mRNA和蛋白表达;将NC-siRNA、TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3转染人胃癌SGC-7901细胞,未转染任何siRNA作为对照组,Western blotting检测转染后各组细胞中TPX2蛋白表达;CCK8实验检测人胃癌SGC-7901细胞转染12、24、48 h后细胞增殖情况;细胞转染48 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blotting检测PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达.结果 胃癌组织中TPX2 mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织(P＜0.01);NC-siRNA组TPX2蛋白表达与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3组的TPX2蛋白表达均显著低于对照组(P＜0.01),TPX2-siRNA3组的抑制效果更明显,选择作为后续研究;NC-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),TPX2-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率均显著低于对照组,且随着时间延长细胞存活率降低(P＜0.01);NC-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),TPX2-siRNA组细胞凋亡率及Cleavedcaspase3蛋白表达均显著高于对照组,PI3K、p-AKT蛋白表达显著低于对照组(P＜0.01).结论 TPX2在胃癌中高表达,沉默TPX2的表达能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖和促进细胞凋亡,其机制可能与PT3K/AKT信号通路的调控有关.
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人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达
目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达.方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定.将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选.用Western blot鉴定基因的表达.结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达.结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础.
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TPX2基因调控p38MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞增殖及促进凋亡的机制研究
目的 探讨Xklp2靶蛋白(TPX2)基因调控p38MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞增殖及促进凋亡的影响及机制.方法 Western blot检测乳腺癌组织及癌旁组织中TPX2基因的表达;siRNA-NC、TPX2-siRNA1和TPX2-siRNA2转染人乳腺癌MCF-7细胞,未转染任何siRNA作为对照组,Western blot检测转染后各组细胞中TPX2蛋白表达;siRNA-NC、TPX2-siRNA转染细胞48 h后,CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测Cleaved easpase3、p38、p-p38蛋白表达. 结果 TPX2在乳腺癌组织的蛋白表达显著高于癌旁组织(P＜0.01);TPX2-siRNA1组和TPX2-siRNA2组细胞中TPX2蛋白表达显著低于对照组(P＜0.01),TPX2-siRNA2组的抑制效果更明显,选择作为后续研究;siRNA-NC组的细胞存活率、细胞凋亡率及Cleaved caspase3、p-p38蛋白表达与对照组差异无统计学意义(P＞0.05),TPX2-siRNA组细胞存活率及p-p38蛋白表达显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved easpase3蛋白表达显著高于对照组(P＜0.01),p38蛋白表达在三个组间差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 TPX2基因在乳腺癌组织中高表达,抑制TPX2的表达可降低细胞增殖及促进细胞凋亡,其机制与p38MAPK信号通路有关.
关键词： TPX2基因 p38MAPK信号通路 乳腺癌 增殖 凋亡 -
肺癌组织中FHIT和TPX2基因的表达及临床意义的研究
目的 探讨FHIT和TPX2基因在肺癌中的表达与临床病理因素的关系.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法,检测FHIT和TPX2基因在肺癌组织和癌旁正常肺组织中的表达. 结果 FHIT基因的表达水平在肺癌组织中的水平比正常肺组织低,差异有统计学意义(P＜0.05),失表达率达74.2%.TPX2基因的表达水平在肺癌组织中的水平比正常肺组织高,差异有统计学意义(P＜0.05),高表达率达64.5%.FHIT的表达异常与吸烟存在相关(P＜0.05),TPX2的表达异常与临床病理因素均无关,两者之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 FHIT基因的失表达和TPX2基因的过表达在肺癌的发生发展中起重要作用,吸烟可能导致FHIT基因表达下降诱发肺癌.
关键词： 肺癌 FHIT基因 TPX2基因 实时荧光定量聚合酶链反应 吸烟 -
食管鳞癌组织中RHAMM和TPX2基因的表达及临床意义的研究
目的:探讨透明质酸介导的细胞游走受体(Receptor for hyaluronan-mediated motility,RHAMM)和Xklp2靶蛋白(Targeting protein for Xklp2.TPX2)基因在食管鳞癌中的表达及其与临床病理因素的关系.方法:采用逆转录聚合酶链反应技术,检测40例食管鳞癌肿瘤组织、癌旁组织、相应食管正常黏膜组织中RHAMM和TPX2基因的表达.结果:RHAMM mRNA在食管鳞癌组织中的表达(65.0%)显著高于癌旁组织(37.5%)及正常黏膜组织(22.5%),且与是否发生淋巴结转移有关(P＜0.01);TPX2 mRNA在食管鳞癌组织中的表达(75.0%)也显著高于癌旁组织(47.5%)及正常黏膜组织(40.0%),与是否发生淋巴结转移及分化程度有关(P＜0.05);RHAMM mRNA及TPX2 mRNA在食管鳞癌组织中的阳性表达具有相关性(P＜0.01,r=0.39).结论:RHAMM及TPX2基因可能共同参与了食管鳞癌的发生、进展及转移.
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TPX2基因在宫颈癌诊断与治疗的临床价值
目的：研究TPX2基因在宫颈癌诊断与治疗的临床价值。方法采用RT-PCR技术和免疫组织化学法检测正常宫颈组织、宫颈鳞癌组织、宫颈鳞癌 Siha 细胞系、宫颈腺癌组织、宫颈腺癌 HeLa 细胞系和上皮内瘤变组织中TPX2基因的mRNA 和蛋白质。结果正常的宫颈组织TPX2mRNA表达量明显低于其他非正常组（P<0.05），TPX2蛋白很少出现在正常宫颈组织中，在宫颈鳞癌组织和上皮内瘤变组织中表达强度增加，TPX2蛋白表达强度与年龄关系不大，与病理级数和淋巴结转移有关。结论 TPX2基因可以作为宫颈癌诊断与治疗的一个指标，具有重要的临床价值。
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慢病毒介导的TPX2基因沉默对人宫颈癌HeLa细胞系增殖、迁移和细胞周期的影响及机制
目的:研究慢病毒介导的基因沉默对人宫颈癌HeLa细胞系增殖、TPX2迁移和细胞周期的影响及其机制.方法:构建种4靶向TPX2基因的慢病毒表达载体(LV-TPX2-shRNA-1/2/3/4),同时构建阴性对照质粒,将5种质粒分别转染到293T细胞中制备慢病毒.慢病毒感染宫颈癌HeLa细胞后,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果.选择沉默效果佳的重组慢病毒进行后续功能实验.分别采用CCK-8法、Transwell迁移实验及流式细胞术检测各组细胞的增殖、迁移及细胞周期分布情况.Western blot检测TPX2-shRNA转染前后Ki-67、cyclin B2、Aurora-A及P53的表达.结果:与对照组比较,构建的靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体均可持续稳定的抑制HeLa细胞TPX2基因的表达,尤其以LV-TPX2-shRNA-1为明显(P<0.01),故选择LV-TPX2-shRNA-1进行后续实验.与对照组比较,沉默TPX2基因的表达能降低HeLa细胞增殖及迁移能力(P<0.05),使G2及S期细胞比例明显增加(P<0.05),且上调P53蛋白的表达水平,下调Ki-67、cyclin B2及Aurora-A蛋白的表达水平(P均<0.05).结论:沉默TPX2基因蛋白表达能抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移能力,可能与其改变细胞周期分布及下调Ki-67、cyclin B2、Aurora-A蛋白表达水平,上调P53蛋白表达水平有关.
