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常见皮肤癣菌18S～28S rDNA ITS序列同源性分析
目的分析常见皮肤癣菌内转录间隔区(ITS,包括5.8S rDNA)序列,探讨快速、准确鉴定菌种的方法;建立种系发生进化树,了解其亲缘关系.方法用形态学方法对16株皮肤癣菌做初步鉴定,PCR扩增各菌ITS区,扩增产物纯化、DNA测序,做序列比对、分析,建立系统发生树.结果检测了16株菌,包括未见文献报道的猪小孢子菌的ITS全序列,其中11株菌与形态学结果一致,1株菌鉴定为金孢子菌,4株菌通过这两种方法均不能确定.在基于ITS序列构建的N-J系统树中,将皮肤癣菌分成3组,这与依形态学所分的3属不同.结论ITS区序列分析法具有高度的准确性、敏感性,检测范围广泛、快速,可应用于菌种鉴定.但也有局限性,应与形态学鉴定相互补充.ITS区序列为今后更加合理地分类和命名皮肤癣菌提供了参考依据.
关键词： 皮肤癣菌 内转录间隔区(ITS) 鉴定 系统发生树 -
内转录间隔区(ITS)序列分析技术对丝状真菌临床分离株鉴定能力的评估
目的 评价内转录间隔区(ITS)序列分析技术对丝状真菌临床分离株的鉴定能力.方法 对267株丝状真菌临床分离株进行ITS序列测定,经与GenBank联合MycoBank数据库进行序列同源性比对获得其菌种信息. 结果 全部菌株均成功获得ITS序列.ITS可将53.9％ (144/267)受试丝状真菌鉴定至种水平,44.2％ (118/267) 鉴定至属水平,5株菌因其ITS序列在不同菌属间均有>95％相似度而无法鉴定.结论 ITS序列分析技术对丝状真菌临床分离株鉴定能力尚可,但因其通用性良好可作为丝状真菌属水平鉴定的优先检测基因.对于进一步的种水平鉴定,则应结合具体情况选用其他功能性基因片段.
关键词： 内转录间隔区(ITS) 序列分析 丝状真菌 鉴定 -
长爪沙鼠源肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列测定及分析
肺孢子虫属(Pneumocystis)内的虫种是引起人及哺乳动物肺孢子虫肺炎(Pneumocystis pneumonia, PCP)的机会性致病病原体.
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肺孢子虫感染大鼠模型的建立及ITS巢式PCR检测敏感性研究
目的 建立肺孢子虫感染大鼠模型并探讨ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫DNA的敏感性. 方法 大鼠分为实验组和对照组,实验组从第1周开始用每周2次每次每只皮下注射地塞米松1 mg的方法诱导,共8周,并分别在首次注射后第2、4、6、8周解剖大鼠制作肺印片、肺组织匀浆液及支气管肺泡灌洗液(BAL)涂片,并进行六亚甲基四胺银(Gomori's methenamine silver,GMS)染色镜检;对照组不作激素注射,并分别在0周和第10周剖杀染色检查.同时分别提取大鼠BAL和肺组织的肺孢子虫DNA进行巢式PCR扩增,比较GMS法和ITS巢式PCR检测的敏感性. 结果 实验组从第6周开始染色镜检,可见少量肺孢子虫包囊,第8周肺印片、肺组织匀浆液均检测到包囊,检出率为100%(10/10),BAL的检出率为80%(8/10),对照组则均未检出.用ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR法均能检测出实验组第8周大鼠BAL和肺组织卡氏肺孢子虫DNA,阳性率为100%(10/10),对照组均为阴性.比较BAL标本、肺印片和肺组织匀浆液GMS染色法的检出率,BAL低,肺组织匀浆液高.其中20%(2/10)大鼠的BAL标本用GMS染色法未能检出,但用巢式PCR方法均能成功扩增.结论成功用地塞米松诱导法建立了肺孢子虫大鼠感染模型;ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫敏感性高、特异性强,可推广应用于临床诊断肺孢子虫肺炎.
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rDNA-ITS序列分析鉴定1例念珠菌性甲真菌病病原
目的 探讨基于核糖体RNA基因(即rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)多态性的序列分析方法(rD-NA-ITS序列分析)在真菌鉴定中的应用.方法 通过PCR扩增与测序的方法测得待检菌株的rDNA-ITS序列,从gene bank获取相似序列,使用BLAST和DNAMAN工具对rDNA-ITS序列进行比对分析,并结合形态学方法进行鉴定.结果 该菌株可被准确地鉴定为Candida metapsilosis(原名为近平滑假丝酵母Ⅲ组),与Candida metapsilosis L7685株具有高度同源性(Homology98.6%,Max ident 98%).结论 rDNA-ITS序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但也存在一定的应用限制,宜与传统的形态学鉴定方法结合用于真菌鉴定.
关键词： rDNA 内转录间隔区(ITS) PCR 念珠菌性甲真菌病 真菌 -
长爪沙鼠和新西兰白兔源肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的测定与分析
目的 测定长爪沙鼠及新西兰白兔源肺孢子虫的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列,并与大鼠源肺孢子虫的相应序列进行比较分析.方法 用地塞米松免疫抑制法诱导长爪沙鼠和新西兰白兔感染肺孢子虫;制作肺印片进行瑞-姬氏复合染色,通过镜检初步了解感染情况;提取肺孢子虫总DNA,设计合成引物进行PCR扩增;纯化扩增产物后克隆测序;与登录GenBank的大鼠源肺孢子虫相关序列进行比较分析. 结果 长爪沙鼠源肺孢子虫的ITS1、5.8S rDNA和ITS2基因序列长分别为158、157和172bp, 新西兰白兔源肺孢子虫的相应序列分别为129、158和178bp. 结论 本实验测得的长爪沙鼠及新西兰白兔源肺孢子虫的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列以往未曾报道,此结果为肺孢子虫的遗传学研究提供了新的资料.
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寄生于猫的马来西亚弓首蛔虫在我国的发现
目的对采集于广州1只猫小肠内、形态与犬弓首蛔虫相似的寄生虫进行分子生物学鉴定.方法以核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)作为遗传标记对虫体进行种特异PCR鉴定,并测定了ITS-2序列,将序列与犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫序列进行比较,得到其序列的相似性和差异性.结果用马来西亚弓首蛔虫种特异性引物对试验虫体DNA进行扩增时,能扩增出明显的DNA片段,而犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫种特异性引物对试验虫体DNA扩增时不能扩增出任何DNA片段.试验虫体的ITS-2序列与马来西亚弓首蛔虫的ITS-2序列相似性为100%,与猫弓首蛔虫的相似性为88.7%～89.0%,与犬弓首蛔虫相似性为75.8%.结论经分子生物学和形态学鉴定,从广州猫体采集的蛔虫为马来西亚弓首蛔虫,在我国为首次发现.
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rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用
目的:通过对3株真菌的rDNA-ITS序列进行分析,以探讨、说明基于核糖体RNA基因(即rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)的多态性的序列分析(rDNA-ITS序列分析)在真菌鉴定中的应用.方法:通过PCR扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的rDNA-ITS序列,从GENBANK获取相似序列,使用BLAST和DNAMAN工具对rDNA-ITS序列进行比对分析.结果:1号真菌菌株与Xylariales sp.LM40(属炭角菌目)同源性高,但尚不能鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株可鉴定到种,为草酸青霉Penicillium oxalicum;3号真菌菌株可鉴定到种内组水平,为近平滑假丝酵母Ⅲ组(新命名为Candida metapsilosis).结论:相对于传统的真菌形态学鉴定方法,rDNA-ITS序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但目前也存在一定的应用限制(受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等影响)并不能鉴定出所有真菌,宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定.
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广州动物园鸬鹚鲁道夫对盲囊线虫的分子鉴定
目的 以核糖体DNA(rDNA)的第一与第二内转录间隔区序列(ITS-1及ITS-2)鉴定从广州动物园鸬鹚体内分离出来的鲁道夫对盲囊线虫种类.方法 将鲁道夫对盲囊线虫样品GZ1、GZ2、GZ3和GZ4的ITS-1、5.8 S、ITS-2进行PCR扩增及序列分析,并与GenBankTM公布的Contracaecum rudolphii A、B种相应序列进行比较.结果 来自鸬鹚体内的4条鲁道夫对盲囊线虫具有相同长度的ITS序列,其ITS-1、5.8 S、ITS-2分别为451、157和268 bp,与GenBankTM公布的鲁道夫对肓囊线虫B种(C.rudolphii B)序列几乎完全一致,但在第108位缺失T.结论 来自广州动物园鸬鹚体内的对盲囊线虫是C.rudolphii B.
关键词： 鸬鹚 对盲囊线虫 内转录间隔区(ITS) PCR扩增 序列比较 -
犬复孔绦虫ITS及5.8S rDNA的PCR扩增、克隆及序列分析
目的 以从我国广东广州和湛江犬小肠中采集的2条犬复孔绦虫作为研究对象,以保守引物NC5及NC2扩增犬复孔绦虫的ITS-1,5.8 S及ITS-2 rDNA片段并进行序列分析.方法 将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR和酶切鉴定后,对阳性菌落进行序列测定.结果 来自广州和湛江的2条犬复孔绦虫ITS及5.8 S rDNA序列总长分别为1536bp、1385bp,2条犬复孔绦虫的ITS-1、ITS-2序列相差较大,分别为20.80%、27.17%,而5.8 S序列相差较小(1.49%).结论 由于犬复孔绦虫ITS序列复杂,种内存在的差异大,故不适于作为犬复孔绦虫种的遗传标记.
关键词： 犬复孔绦虫 内转录间隔区(ITS) PCR 序列分析 -
两种巢式PCR法检测实验大鼠卡氏肺孢子虫的灵敏度评价
目的 对ITS1-5.8S rRNA-ITS2 巢式PCR 法与mtLSUrRNA 巢式PCR 法检测大鼠卡氏肺孢子虫的敏感性进行评价.方法 把大鼠随机分为7 组(6 组实验组,1 组对照组),每组10 只,采用地塞米松免疫抑制法诱导实验组大鼠感染肺孢子虫;自第3 周开始每周剖杀1 组实验鼠,收集第3 周至第8 周实验组大鼠肺组织(LT,lung tissue) 和支气管肺泡灌洗液(BALF,bronchoalveolar lavage fluid) 标本.同时采用镜检法、ITS1-5.8S rRNA-ITS2 巢式PCR 法和mtLSUrRNA 巢式PCR 法对大鼠LT 和BALF 标本进行检测,并对结果 进行统计学分析.结果 采用GMS 染色镜检法于第5 周开始检出肺孢子虫包囊,第6、7 周包囊数多.采用ITS1-5.8S rRNA-ITS2-巢式PCR 法和mtLSUrRNA 巢式PCR 法对实验感染大鼠LT 和BALF 进行检测,前者卡氏肺孢子虫阳性率分别为第3 周20% (2/10)和0(0/10);第4 周70%(7/10)和10%(1/10);第5 周90%(9/10)和30%(3/10);第6 周90%(9/10)和80%(8/10);第7 周100%(10/10)和80%(8/10);第8 周40%(5/8)和40%(5/8).后者卡氏肺孢子虫阳性率分别为第3 周100% (10/10)和100(10/10);第4 周100%(10/10)和80%(8/10);第5 周100%(10/10)和50%(5/10);第6 周90%(9/10)和100%(10/10);第7 周100%(10/10)和80%(8/10);第8 周100%(8/8)和87.5%(7/8).经χ2检验,在大鼠无明显症状阶段(3~4w)时,两种巢式PCR 方法 检测敏感性差异有统计学意义.有明显症状阶段(5~8wq)时,其敏感性差异无统计学意义;同时统计学分析显示不同来源的标本对不同方法 敏感性不同,采用mt-LSU 巢式PCR 检测时,LT和BALF标本敏感性差异无统计学意义,采用ITS-巢式PCR检测时,对LT检测的敏感性更高.结论 mtLSU-巢式PCR 法检测实验大鼠中检出卡氏肺孢子虫敏感性高于ITS1-5.8S rRNA-ITS2-巢式PCR 法.
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AIDS患者合并感染耶氏肺孢子虫的巢式PCR检测及ITS基因的克隆测序
目的 探讨ITS巢式PCR检测AIDS患者合并耶氏肺孢子虫感染的应用价值并对ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因进行克隆测序.方法 收集AIDS患者痰液标本,用二硫苏糖醇(DTT)消化处理后进行六亚甲基四胺银(CMS)染色镜检;提取肺孢子虫DNA后进行巢式PCR扩增,选取GMS染色和PCR同时阳性的112号和仅PCR阳性的185、200号病例的PCR产物进行TA克隆、测序,然后用Blastn程序和DNANAN软件对所测序列进行同源性比较和序列间比对,并和GenBank登录的耶氏肺孢子虫ITS1-5.KS rDNA-ITS2序列进行比较分析.结果 用ITS巢式PCR法检测AIDS患者99例,耶氏肺孢子虫DNA阳性43例,阳性率为43.4%(43/99),用GMS染色法检测,阳性率为4.04%(4/99),两者比较,有非常显著性差异(P<0.01).TA克隆112、185、200号病例的耶氏肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因序列长度分别为523bp、515bp、51lbp,三者之间的基因同源性为95%～97%,与GenBank登录的耶氏肺孢子虫(U07220)、(U07221)、(U07222)和(U07226)的ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因的同源性为95%～98%,其变异位点多在ITS1和ITS2基因片段.结论 ITS巢式PCR法检测耶氏肺孢子虫敏感性明显高于GMS染色法.ITS巢式PCR法可作为肺孢子虫肺炎早期诊断方法,尤其适用无创性标本的检测,CMS染色法对无创性标本痰液的检测敏感性低,在临床上意义不大;成功获取广西株耶氏肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2的基因序列,与GenBank登录的外国株耶氏肺孢子虫基因序列高度同源,其中5.8S rDNA高度保守,ITS1和ITS2基因变异较大.
关键词： AIDS 耶氏肺孢子虫 内转录间隔区(ITS) 巢式PCR -
AIDS患者合并感染耶氏肺孢子虫的 ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列测定及基因型初步分析
目的 测定AIDS患者痰液标本中耶氏肺孢子虫的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列并进行基因型分析.方法 收集AJDS患者痰液标本,二硫苏糖醇(DTT)消化处理后进行六亚甲基四胺银(GMS)染色镜检;提取肺孢子虫DNA,巢式PCR扩增后进行测序,用Blast程序和DNAMAN软件对所测序列进行同源性检索和序列间比对,并和SD大鼠卡氏肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列进行比较分析.结果 GMS染色法未检测到肺孢子虫,巢式PER成功扩增出4例(31%),其ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因序列长度为469 bp,ITS1、5.8S rDNA、rTS2基因片段分别为146、158、165 bp,与SD大鼠ITS1-5.8S rDNA-ITS2的基因同源性为86%(152/176),其中多为5.8S rDNA同源86%(136/158),ITS基因间未发现显著性同源;病例间耶氏肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2的基因同源性为98%～99%,其中5.8S rDNA高度保守,ITS1基因存在4个差异位点并具规律性,据此把耶氏肺孢子虫初步分为A型和B型;ITS2基因存在3个基因位点,但差异无规律性.结论 成功从AIDS患者痰液标本中获取耶氏肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因序列,其和大鼠源基因差异明显,不同人源宿主耶氏肺孢子虫可存在不同基因型.
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基于ITS序列分析鉴别冬虫夏草与古尼虫草
目的:冬虫夏草与古尼虫草在外观上相似度高,易混淆,本研究将从基因水平对两者进行准确鉴别.方法:通过聚合酶链式反应扩增,得到样品的内转录间隔区(ITS)序列,同时从GenBank下载2种虫草的ITS序列;利用CodonCode Aligner 和MEGA软件对ITS序列进行分析,找到2种虫草差异的酶切位点;通过聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)实验进行验证.结果:在ITS序列上,冬虫夏草存在1个SacⅡ酶切位点,而古尼虫草不具有该位点.PCR-RFLP的实验结果表明,冬虫夏草ITS序列的PCR产物可被限制性内切酶SacⅡ切割为2个片段,大小分别约为488 bp和128 bp,古尼虫草不能被SacⅡ切割,所以酶切前后其PCR产物在琼脂糖凝胶图上的位置没有变化.从子实体取样和从虫体取样得到一致的结果.结论:PCR-RFLP法可以将冬虫夏草与古尼虫草明确区分,取样部位不同对本方法的结果没有影响.
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冬虫夏草与5种人工发酵菌丝体的DNA分子鉴别方法
目的:建立冬虫夏草与人工发酵菌丝体的鉴别方法.方法:通过聚合酶链式反应(PCR),扩增基因组上的核糖体基因内转录间隔区(ITS),继而用限制性内切酶Xho Ⅰ对该聚合酶链式反应产物进行酶切,将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳及紫外成像;通过聚合酶链式反应扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (COⅠ)的编码基因,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及紫外成像.结果:冬虫夏草ITS的PCR产物能够被Xho Ⅰ酶切成2个片段.而5种人工发酵菌丝体中,有4种不能够被酶切;由于来源于冬虫夏草无性型中华被毛孢,百令胶囊可被酶切且切割条带大小与冬虫夏草组一致.冬虫夏草样品全部扩增得到COⅠ基因(CO Ⅰ)片段,而5种人工发酵菌丝体均未扩增出该片段.结论:结合聚合酶链式反应限制性内切酶片段长度多态性法以及COⅠ聚合酶链式反应扩增,可以鉴别冬虫夏草与人工发酵菌丝体.
