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细菌伴侣蛋白Skp可通过C5a受体引起白细胞的趋化运动
目的证明大肠杆菌伴侣蛋白Skp可以诱导单核细胞和分叶核白细胞(PMN)产生趋化运动.方法分离提纯Skp,并通过分子质量测定和氨基端的氨基酸测序予以证实.使用S19核糖体蛋白和C5a的合成模拟肽链,进行受体拈抗试验.使用Skp的合成模拟肽链进行体外趋化实验分析其对白细胞的趋化作用.结果Skp对单核细胞和PMN具有趋化活性.其作用于C5a受体,也通过两步结合机制使受体活化.并推测Skp分子结构中-Gln83-Asp84-Arg85-及-Ser58-Asp59-Arg60-序列为可能的第二受体结合位点.结论C5a受体作为白细胞的趋化因子受体迄今为止被证明是两个内源性化学介质:C5a和S19核糖蛋白二聚体的受体.在此基础上,我们首次证明了大肠杆菌的伴侣蛋白Skp是一种来源于大肠杆菌的趋化因子.
关键词： C5a受体 C5a S19核糖蛋白二聚体 白细胞趋化运动 Skp -
补体C5a、C5a受体及其拮抗剂的研究进展
C5a是重要的补体活化产物之一,它与相应的C5a受体结合被激活后,参与了多种疾病的病理过程,如急性肺损伤、脓毒血症、类风湿性关节炎、肾小球肾炎等疾病.如何阻断C5a信号的下传,从而减轻炎症反应一直是免疫学研究的热点问题.目前C5a和C5a受体的拮抗剂主要分为抗C5a抗体、小分子拮抗剂、C5a反义肽、C5a突变体和细菌来源的趋化抑制蛋白等.本文着重介绍C5a和C5a受体的结构与功能,以及相关拮抗剂的研究进展.
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C5aR拮抗剂在油酸诱导的小胶质细胞炎性改变中的作用
目的 观察油酸(oleic acid,OA)及C5a受体(C5aR)拮抗剂(PMX53)干预后小胶质细胞的炎性改变,探讨C5a-C5aR在油酸诱导的小胶质细胞炎症中的作用.方法 取新生1d龄小鼠,分离脑组织,原代培养小胶质细胞并进行分离纯化及鉴定.纯化小胶质细胞随机分成5组,分别为正常对照组、OA 100 μmol/L处理组、OA 100 μmol/L+PMX53 100 nmol/L处理组、OA 200 μmol/L处理组、OA 200μmoL/L+PMX53 100 nmol/L处理组.应用Western印迹、ELISA法检测不同浓度OA及OA +PMX53干预后小胶质细胞Iba-1、C5aR蛋白及TNF-αt表达变化.结果 成功培养小胶质细胞,且纯度≥99％.不同浓度OA干预后,Iba-1、C5aR蛋白表达及TNF-α浓度较对照组明显升高(P＜0.01);OA+PMX53干预组较OA组Iba-1及TNF-α浓度有所下降(P＜0.01);OA+PMx53干预组较OA组C5aR蛋白表达有所下降(OA100 vs.OA100 +PMX53,P＜0.05,OA200 vs.OA200+PMX53,P＜0.01).200 μmoL/L OA干预组较100μmol/L OA干预组Iba-1、C5aR蛋白表达及TNF-α浓度高(P＜0.01).结论 应用C5aR拮抗剂可以抑制油酸诱导的小胶质细胞的炎症反应,提示C5a-C5aR参与了油酸诱发的炎症反应,推测C5aR拮抗剂在神经系统炎性损伤中具有神经保护作用.
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C5a对中性粒细胞和肾小球内皮细胞粘附行为的影响
目的:为揭示C5a和C5aR对肾小球内皮细胞(GVEC)-中性粒细胞(PMN)粘附的影响及其影响程度.方法:采用免疫组化胶体金银染色检测C5aR在人GVEC上的表达,并用微管吸吮技术定量测定了经C5a诱导后,GVEC和PMN细胞对间的粘附力,同时通过测定粘附的PMN中髓过氧化物酶(MPO)含量变化,观察不同剂量C5a对粘附的影响.结果:发现GVEC上分布C5aR,经2 000 ng/ml C5a刺激,GVEC-PMN间粘附力(Fa)达0.014 dyn,相对粘附应力(S1)为1 720.0 dyn/cm2,与对照组Fa(0.001 dyn)和S1(339.9 dyn/cm2)均有非常显著差异(P＜0.01).MPO测定结果表明GVEC-PMN粘附的发生依赖于C5a剂量.结论:从生物力学角度直接定量阐明了C5a-C5aR对GVEC-PMN粘附行为的重要影响.
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C5a受体拮抗剂对小鼠缺血再灌注损伤的保护作用
目的 通过抑制C5a受体活性,进而观察其在缺血再灌注损伤中的作用.方法 使用C5a受体拮抗剂及制造梗死模型对小鼠大脑中动脉进行临时闭塞.24 h后评估缺血再灌注损伤的结果,进行神经学损伤评分和测算脑梗死体积.结果 使用C5a受体拮抗剂治疗的小鼠神经功能有所改善、梗死体积显著减少.结论 C5a受体拮抗剂显著改变小鼠缺血再灌注损伤程度.
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靶向大鼠C5aR基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定
构建靶向大鼠C5aR基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,验证C5aR蛋白的功能,为后续进一步研究C5aR在免疫治疗中的作用奠定基础.具体方法是根据基因库提供的大鼠C5aR mRNA核苷酸序列(序列号:NM_053619),设计并合成短发夹结构的互补DNA序列,克隆到经BamHI和EcoR I双酶切的线性化质粒pLVX-shRNA,构建重组质粒,并予以DNA测序鉴定.重组干扰质粒构建成功后,通过脂质体2000转染大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,LPS处理后收集细胞,采用荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)和Western blotting法检测干扰质粒对C5aR基因的表达抑制效应.通过尾静脉高压注射技术将重组干扰质粒导入Wistar大鼠肾脏,采用腹腔注射LPS方法复制脓毒血症急性肾损伤模型,大鼠随机分为正常对照组、LPS处理组、LPS+C5aR shRNA转染组,采用ELISA方法检测血清中Cr、BUN以及TNF-α、IL-6等炎性因子的含量.结果显示构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致,重组质粒构建成功.转染C5aR shRNA后,NRK-52E细胞中C5aR mRNA和C5aR蛋白表达水平显著下降(P＜0.05).该重组干扰质粒能有效抑制C5aR基因的表达,能显著抑制由LPS诱导的TNF-α、IL-6等炎性因子的释放,改善大鼠肾脏功能,对LPS诱导的肾脓毒血症损伤具有明显保护作用.
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细菌伴侣蛋白Skp引起白细胞趋化运动的体内实验研究
目的 细菌伴侣蛋白(Seventeen-Kilodalton protein,Skp)可以作用于C5a受体引起白细胞的趋化作用.该研究的目的Skp在生物体内和体外实验一样可以引起白细胞的趋化运动,且是细菌提取掖中主要的白细胞趋化因子.方法 制备Skp的特异性抗体,进行免疫吸收实验,进而豚鼠体内实验,观察组织标本.结果 E.Coli提取液中主要的白细胞趋化活性来自于Skp.Skp提纯物注射后可在豚鼠皮内发生单核细胞和PMNs的大量浸润.结论 细菌体内的Skp可能与在细菌壁发生补体系统激活产生的C5a共同引起白细胞的趋化反应.对于革兰氏阴性病原菌的先天性免疫具有重要意义.
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细菌伴侣蛋白Skp对C5a受体的作用位点
目的Skp(Seventeen-Kilodalton protein)已被证明是C5a受体的两个内源性的化学配体:C5a和S19核糖体蛋白二聚体(RPS19 dimer)之外的第3个配体,通过C5a受体引起白细胞的趋化运动.该研究目的:阐明Skp如何与受体结合及与受体结合的位点.方法使用S19核糖体蛋白(RPS19)和C5a的合成模拟肽链,进行的受体拮抗试验.使用Skp的合成模拟肽链进行趋化运动分析试验.结果证明Skp与RPS19和C5a一样,结合于C5a受体的相同结合区域,且也通过两步结合机制使受体活化.并初步推测了Skp分子结构中可能的受体结合位点.结论C5a受体可以通过识别革兰氏阴性细菌蛋白,在先天性免疫方面起到重要的作用.
关键词： Skp C5a S19核糖蛋白二聚体 白细胞趋化运动 C5a受体 -
C5a-C5aR在棕榈酸诱导的小胶质细胞炎症中的作用及机制
目的 观察棕榈酸(PA)及C5a受体(C5aR)拮抗剂(PMX53)干预后小胶质细胞的炎性改变,探讨C5a-C5aR在PA诱导的小胶质细胞炎症中的作用及机制.方法 取新生1日龄小鼠,分离脑组织,原代培养小胶质细胞并进行分离纯化及鉴定.纯化小胶质细胞随机分成:对照组、PA组、PA+PMX53组.分别应用QT-PCR、Western blot及ELISA法检测PA及PA+PMX53干预后小胶质细胞Iba-1蛋白、ERK1/2 mRNA及蛋白、TNF-α表达变化.结果 PA干预后,Iba-1蛋白及TNF-α浓度较对照组明显升高(P<0.001);PA组ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2蛋白表达较对照组明显升高(P=0.0056),而ERK1/2蛋白与对照组无明显差异(P>0.05).PA+PMX53干预组较PA组Iba-1蛋白、p-ERK1/2蛋白、ERK1/2 mRNA及TNF-α浓度表达有所下降(P<0.001);ERK1/2蛋白在各组比较差异无显著性.结论 PA可能通过C5a-C5aR激活ERK通路,诱发小胶质细胞炎症反应,C5aR拮抗剂在神经系统炎性损伤疾病中具有神经保护作用.
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中和C5a过敏毒素的分子设计研究
目的 从蛋白质结构与功能的关系出发，探讨C5aR与其配体C5a的结合位。方法按分子设计理论，采用亲水性方案寻找C5aR胞外区高亲水性区域，Fmoc方案人工合成C5aR第9～30位氨基酸基序(P22肽),经高压液相色谱纯化，毛细管电泳鉴定。结果合成多肽(P22)的纯度为95.19%,每次缩合的平均效率为99.78%；能与anti-C5aR McAb(S5/1,Serotic公司)有效地结合，酶联OD490值极显著高于同浓度对照多肽C20；还可被配体rh-C5a(10μg/L)明显抑制而降低其酶联OD值(P＜0.05)。此外，10μg/L P22还可抑制rh-C5a所致U937细胞胞浆Ca2+升高(P＜0.01)。结论从C5aR分子中寻找C5a结合位基序并予以人工合成，可中和C5a的过敏毒素作用，为治疗C5a及其相关疾病进行新型的药物设计。
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血脂代谢紊乱与外周血白细胞C5a受体表达的关系
探讨血脂代谢紊乱与外周血白细胞C5a受体表达的关系.方法 高脂血症患者60人,同期正常对照30人,测定血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、脂蛋白(a)、氧化低密度脂蛋(oxLDL)等脂代谢指标以及补体C3、C4,使用流式细胞仪检测外周血白细胞C5a受体,分析脂代谢异常以及补体C3、C45平与C5a受体表达的关系.结果 高脂血症组总胆固醇、甘油三脂、LDL-C、oxLDL、脂蛋白(a)、补体C3、C4等较对照组明显升高;高脂血症组CD88阳性淋巴细胞、单核细胞、粒细胞平均荧光强度有升高趋势(3.05±0.91比2.96±0.76、4.90±1.33比4.58±1.13、13.87±4.77比13.60±3.54),但差异无统计学意义(P>0.05);直线相关分析,CD88阳性单核细胞及粒细胞平均荧光强度与脂蛋白(a)正相关,CD88阳性单核细胞及粒细胞平均荧光强度与oxLDL亦呈正相关,与总胆固醇、甘油三脂、LDL-C、HDL-C、补体C3和C4不相关;偏相关分析及多元回归显示oxLDL是CD88阳性单核细胞及粒细胞平均荧光强度的独立预测因素.结论 oxLDL可能影响外周血白细胞C5a受体的表达.
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烧伤患者血清对肺毛细血管内皮细胞与中性粒细胞粘附特性的研究
目的探讨烧伤继发急性肺损伤(acute lung injury,ALI)患者肺毛细血管内皮细胞(PVEC)与中性粒细胞(PMN)的粘附能力,观察C5a在PVEC-PMN粘附行为中的作用程度及规律. 方法采用微管吸吮技术,定量测定PVEC-PMN之间粘附力值变化;测定髓过氧化酶(MPO)活性,反映PVEC粘附PMN的数量. 结果随着rh-C5a浓度上升,PVEC粘附了更多的PMN;粘附力值也逐渐增加,300 μg/L rh- C5a时差异有非常显著性意义(P<0.01);MPO也随之上升;工作浓度为1∶ 10 4的anti-C5aR McAb可缓解急性肺损伤(ALI)血清所致的MPO增加,呈量效关系, 结论 C5a、C5aR共同参与了PVEC-PMN的粘附过程.而且急性肺损伤所致的粘附力值上升可被anti-C5aR McAb所抑制,提示C5a 、C5aR在烧伤继发的急性肺损伤的发病机制中可能起到了重要作用.
