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转录抑制因子ZHX2对AFP启动子的抑制作用
目的 探讨转录抑制因子ZHX2对人甲胎蛋白(AFP)启动子的抑制作用.方法 PCR扩增人ZHX2基因,构建ZHX2与绿色荧光蛋白和HA-tag融合表达载体pEGFP-ZUX2、pcDNA-ZHX2-HA,共转染后通过荧光显微镜及Western blot检测融合基因的表达.扩增人AFP核心启动子269 bp插入pGL3-Basic,构建报告质粒phAF269.将pcDNA-ZHX2-HA和phAF269共转染HepG2细胞,48 h后裂解细胞,双荧光检测分析ZHX2对AFP启动子的抑制作用.结果 荧光显微镜及Western blot检测证实pEGFP-ZHX2和pcDNA-ZHX2-HA可在体外有效表达ZHX2融合蛋白,双荧光实验表明报告质粒phAF269具有AFP启动子活性,且pcDNA-ZHX2-HA与phAF269共转染HepG2后可显著抑制AFP启动子的转录作用,此抑制作用具有剂量依赖性.结论 成功构建两种新型转录抑制因子ZHX2融合表达载体,并证实其对人AFP启动子的抑制作用,为进一步探讨肝癌发生中AFP表达调控机制及提高AFP介导的靶向肿瘤基因治疗提供基础资料.
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miR-29c互补序列与AFP启动子在肝癌基因靶向治疗中的应用研究
目的 建立基于肿瘤特异性启动子和microRNA (miR)互补序列的肝癌基因靶向治疗系统.方法 分别检测甲胎蛋白AFP启动子和miR-29c在不同的人肝癌细胞株和正常肝细胞株中的表达活性;比较分析AFP启动子和新的靶向系统AFP-MiR-29c-TS(miR-29c-TS,miR-29c互补序列)在肝癌细胞株中的靶向特征；对比分析AFP-E1A和AFP-MiR-29c-TS-E1A在肝癌治疗中的疗效和特异性差异.结果 AFP启动子在人肝癌细胞株HepG2和Huh7中特异性高表达,miR-29c在人肝细胞株LO2中特异性高表达；在肝细胞株中,AFP-MiR-29c-TS的活性较AFP启动子明显降低(P＜0.01)；AFP-E1A和AFP-MiR-29c-TS-E1A在肝癌治疗中的疗效差异不具有统计学意义.结论 AFP-MiR-29c-TS是肝癌基因靶向治疗安全、有效的载体系统.
关键词： 肝癌 AFP启动子 microRNA(miR) 靶向治疗 -
pAFP-P53-EGFP靶向诱导AFP阳性肝癌细胞凋亡
目的 研究pAFP-P53-EGFP对AFP阳性肝癌细胞的靶向促凋亡作用.方法 将SD大鼠AFP启动子、沉默子和远端增强子Ⅲ组合为1.2kb的AFP基因调控序列,导入pEGFP-N1质粒的启动子处,构建pAFP-EGFP同时引入P53基因片段,构建pAFP-P53-EGFP重组质粒.转染HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,流式细胞术分析各细胞凋亡情况.分别将质粒pAFP-EGFP和pAFP-P53-EGFP转染HepG2细胞进行DNAladder分析及电镜观察细胞超徽结构.结果 pAFP-P53-EGFP重组质粒转染HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,各组细胞凋亡率分别为:HepG2组%gate=2.65±0.08;HeLa组%gate=0.42±0.025;SMMC7721组%gate=0.39±0.018.AFP阳性的HepG2细胞凋亡率明显高于SMMC7721、HeLa细胞(P<0.05).且转染pAFP-P53-EGFP质粒的HepG2细胞出现明显的DNA ladder,细胞超微结构亦显示出现凋亡.结论 pAFP-P53-EGFP可以在AFP阳性细胞中相对专-表达,且pAFP-P53-EGFP可通过诱导细胞凋亡从而达到抑制肿瘤作用.
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含AFP启动子腺病毒载体构建的基础研究
[目的]为提高基因治疗载体的靶向性,在现有的溶瘤性腺病毒基础上,应用细菌内同源重组方法构建含AFP启动子和E1A基因的条件复制性腺病毒载体.[方法]应用限制性内切酶以及体外重组技术获取目的片段AFP-AP-IRES-E1Am并进行重组质粒的筛选;将目的片段插入Pshuttle穿梭质粒中;重组的Pshuttle质粒应用PmeI线性化,与含腺病毒骨架DNA、删除了腺病毒E1、E3区的pAdEasy1质粒在BJ5183大肠杆菌细胞中同源重组形成新重组体;抽提重组体DNA,用PacI酶切后,转染至人胚肾细胞株HEk293细胞中进行复制包装,扩增纯化;进行病毒检测.[结果]经用具有Amp抗性及kan抗性的培养板和多种限制性内切酶酶切筛选,证实应用同源重组方法构建了含AFP启动子和目的基因E1A的腺病毒载体;该重组腺病毒可转染HEk293细胞,并进行有效复制.[结论]成功构建了具有特异靶向性的条件复制腺病毒载体,为进一步研究该腺病毒的功能提供了条件.
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两种不同AFP启动子控制下表达HIV vpr基因的重组非复制型腺病毒获得及鉴定
目的构建及包装由全长5.1kbAFP启动子和低氧反应元件(HRE)与0.3kbAFP启动子两者组合的杂合0.3kbAFP启动子控制下表达HIV vpr基因的两种重组非复制型腺病毒.方法采用细菌内同源重组腺病毒载体制备方法和PacI酶切、PCR、Southern Blot鉴定方法.结果构建及包装出由这两种AFP启动子控制下表达HIV vpr基因的重组非复制型腺病毒,经PacI酶切、PCR和Southern Blot基因整合分析证明构建成功.结论我们成功构建了的全长5.1kbAFP启动子和HRE与0.3kbAFP启动子两者组合的杂合0.3kbAFP启动子控制下表达HIV vpr基因的重组非复制型腺病毒,为使HIV vpr基因更好的用于肝癌特异性基因治疗提供了可能和基础.
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肝癌组织特异性Pafp IRES2-EGFP表达载体的构建及表达
目的 构建AFP小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体,观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达.方法 从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP小启动子区序列和CMV增强子(ECMV),利用重叠延伸PCR方法(SOE)获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定.通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞,荧光显微镜下观察其表达的组织特异性.结果 从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到-537bp的条带,均与预期序列长度一致.SOE产物与pIRES2-EGFP连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经Nde I+Nhe I限制性酶谱分析酶解出537bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致.结论 本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因.
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AFP启动子介导胸苷激酶表达载体的构建及其特异性表达
[目的]构建AFP启动子介导HSV-TK基因表达载体,并对其在肝癌细胞中特异性表达进行分析.[方法]采用PCR法扩增人AFP基因启动子.回收纯化后克隆入pBluescript Ⅱ KDR-TK相同克隆位点,切取AFP-TK片段,然后通过酶联反应插入到pEGFP-C1中,构建成pEGFP-C1-AFP-TK.对获得的片段进行鉴定、细胞靶向和外源基因表达的鉴定.[结果]序列分析表明,该启动子含300 bp核苷酸,与已报道的序列比较,100%相符.限制性酶切分析,重组质粒pEGFP-C1-AFP-TK已经克隆AFP启动子.RT-PCR及Western blotting分析pEGFP-C1-AFP-TK转染后的HepG2细胞后,表明TK基因在mRNA水平上能有效的表达,裂解后的HepG2细胞膜蛋白中有相对分子质量约61～83 ku大小的特异性条带.[结论]人肝细胞癌(HepG2)靶向性质粒pEGFP-C1-AFP-TK构建成功.
关键词： AFP启动子 HepG2细胞 靶向表达 单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶激酶1 -
AFP启动子调控增强型绿色荧光蛋白在人肝癌细胞中表达的研究
目的研究人0.3 kb的AFP启动子序列对EGFP在人肝癌细胞中表达的影响.方法通过设计含有特定酶切位点的引物,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋白启动子(AFP promoter)序列,分别构建含有AFP启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及AFP启动子序列和DTA基因的真核表达载体pAF-EGFP、pAF- DTA;将pAF- EGFP转染HepG2、SMMC-7721及NIH3T3后进行荧光强度检测.结果转染pAF-EGFP质粒细胞的EGFP表达量在HepG2细胞中明显高于SMMC-7721、NIH3T3细胞,组间差异显著(P<0.01).结论 AFP启动子可以特异性地启动它后面的目的基因在AFP阳性的细胞中高效表达.
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AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组载体的构建及其在肝癌H22细胞中的表达
目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β, 并检测其在真核细胞内的表达.方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因, 将其克隆至pIRES2-EGFP载体, 构建肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP.RT-PCR扩增小鼠IL-1β基因, 克隆至pafpIRES2-EGFP, 进行酶谱分析及DNA序列测定.利用jetPEI法将其分别转染H22细胞和YAC-1细胞, 倒置相差荧光显微镜下观察, RT-PCR分析mIL-1β表达水平的变化.结果:SOE-PCR方法获得长度为537 bp的AFP和ECMV嵌合基因, 克隆后经限制性酶切和DNA序列分析确认成功构建了小鼠肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP.PCR扩增小鼠IL-1β基因后将其克隆至pafpIRES2-EGFP, 获得AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β, 细胞转染分析证实, 该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性高效表达, RT-PCR检测可见转染细胞中mIL-1β水平明显升高.结论:成功构建真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β, 该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达IL-1β.
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AFP启动子控制的在肝癌细胞中特异性表达绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒载体的研究
目的 研究由AFP启动子控制的腺病毒载体在肝癌细胞中定向表达报告基因活性.方法 采用分子生物学技术手段,将AFP启动子和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出携带GFP基因的腺病毒AdAFP-GFP.荧光显微镜下观察GFP基因在肝癌细胞中的特异性表达.结果 AdAFP-GFP能够介导GFP基因在肝癌细胞中特异性表达,多数细胞呈现荧光反应,而在正常细胞中未发现GFP的表达.结论 采用AFP启动子可以实现目的基因在肝癌细胞中定向而特异性表达,这项研究应用于抗肿瘤基因治疗,将有利于显著提高治疗效果.
