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双特异性启动子调控条件复制腺病毒载体的构建
目的 构建并鉴定既能在人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒早期区域1A(E1A)基因,又能在胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子引导入钠碘转染体(hNIS)基因的腺病毒载体.方法 采用免疫印迹分析检测人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87、人神经胶质瘤细胞U251和人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞感染病毒前自身GFAP和端粒酶蛋白的表达情况.通过PCR扩增获得hTERT启动子、GFAP启动子及hNIS基因,采用基因合成腺病毒E1A基因.采用hTERT和GFAP启动子重组质粒转染MRC-5、U251、U87细胞,转染24 h后应用荧光分析法检测hTERT启动子及GFAP启动子的启动活性.再将上述特异性启动子分别与E1A基因和hNIS基因连接,后插入穿梭质粒pDC311中,构建重组质粒pDC311-Tp-E1A-Gp-NIS,并应用EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切及测序鉴定.将pDC311-Tp-E1A-Gp-NIS与骨架腺病毒质粒pBHGlox△E1-3Cre共转染人胚肾293细胞,得到条件复制腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS后,分别感染293、MRC-5、U87和U251细胞,利用病毒空斑形成实验检测条件复制腺病毒的复制能力.使用重组腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS及Ad-CMV-EGFP(对照)感染U251、U87及MRC-5细胞后,采用γ计数器测定由hNIS基因介导的摄125I能力.结果 在U87和U251细胞中,均有相对分子质量120000的端粒酶和49000的GFAP蛋白的表达,在MRC-5中,则无表达.GFAP启动子和hTERT启动子能引导目标基因胶质瘤靶向性表达,启动效率分别为U87细胞中(62.10±6.26)％和(49.24±1.73)％,U251细胞中(59.75±34.36)％和(37.31±16.86)％.限制性内切酶能将质粒pDC311-Tp-E1A-Gp-NIS酶切成3252、5500 bp的片段,经测序鉴定后与预计序列一致.成功构建的Ad-Tp-E1A-Gp-NIS条件复制腺病毒,在U87和U251细胞能很好的产生病毒颗粒,在293细胞也能实现复制,但是在MRC-5细胞中则无病毒产生.U251和U87细胞感染Ad-Tp-E1A-Gp-NIS后均具备了较明显的摄125I能力,约为对照组的93.4倍和107.1倍[(60 679.42±635.61)cpm/100 mg比(656.67±9.25) cpm/100 mg,(69 593.10±1842.89)cpm/100 mg比(660.63±16.01)cpm/100 mg,均P＜0.05].MRC-5细胞感染后与对照组比较则未见明显的125I摄取[(649.67± 13.66)cpm/100 mg比(649.67± 13.66) cpm/100 mg,P＞0.05].结论 构建的条件复制腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS具有良好的条件复制能力,并可以摄125I介导放射性碘治疗.
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hTERT和GFAP双启动子条件复制腺病毒介导放射性碘治疗脑胶质瘤的实验研究
目的 利用条件复制腺病毒Ad-Tp-E1 a-Gp-NIS感染脑胶质瘤细胞,探讨其介导靶向性放射性碘治疗脑胶质瘤的可行性.方法 克隆人端粒反转录酶(hTERT)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子,荧光素酶分析法检测启动子启动效率.构建并纯化条件复制腺病毒Ad-Tp-E1a-Gp-NIS,进行肿瘤选择性病毒复制实验.U87和U251细胞感染Ad-Tp-E1a-Gp-NIS后,进行Westernblot分析蛋白质表达,125I内流及外流和131I克隆形成实验.结果 荧光素分析实验证明,hTERT和GFAP启动子分别可以引导荧光素蛋白在U251和U87细胞中表达,表达效率为37.31％ ～49.00％(F=5.87,P＜0.05)和59.75％ ～62.10％ (F=11.89,P＜0.01).Ad-Tp-E1 a-Gp-NIS能够在hTERT阳性和GFAP阳性实现肿瘤选择性复制,且在GFAP启动子引导下能成功表达hNIS基因.Western blot分析表明,hTERT蛋白和GFAP蛋白在U87和U251细胞中显示出相对分子质量为120×103和49×103的条带.感染Ad-Tp-E1 a-Gp-NIS后,U87细胞摄碘能力提高78.80倍(F=2 914.58,P＜0.01),U251细胞摄碘能力提高92.48倍(F=2 275.91,P＜0.01).体外细胞克隆分析证明,感染病毒并在131I中孵育12 h后,超过90％的肿瘤细胞被杀死,而对照组细胞仅有65％(t=11.73 ～78.33,P＜0.01).结论 Ad-Tp-E1 a-Gp-NIS能实现条件性复制并具有明确的肿瘤靶向性.在细胞水平实验中,能引导放射性131I杀死胶质瘤细胞.
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表达单纯疱疹病毒胸苷激酶的溶瘤腺病毒靶向癌症治疗：在体外评估
目的：我们希望评估与单纯疱疹病毒胸苷激酶相结合的溶瘤腺病毒治疗效果是否更好。方法我们构建了一种新型的溶瘤腺病毒Ad-ETK，它包含人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子，E1A基因的编码序列，内部核糖体进入位点序列（IRES）和疱疹单纯病毒胸苷激酶（HSV-TK）编码序列。腺病毒Ad-ETK感染了各种肿瘤细胞，并通过用RT-PCR表明的E1A和HSV-TK基因的表达。同时测定了病毒的溶瘤能力及其与HSV-TK系统协同效果。并采用流式细胞仪测量病毒感染效率。结果溶瘤腺病毒Ad-ETK表达了E1A和HSV-TK基因，并且选择性的hTERT-阳性的肿瘤细胞中复制，复制的子代病毒可达150 IU/cell。在体外研究表明，Ad-ETK加更昔洛韦（GCV）有明显的导致细胞死亡的效果。结论溶瘤腺病毒加HSV-TK/GCV自杀基因显著改善治疗效果，在活体评估的结果预示的溶瘤病毒有很好的开发前景。
关键词： 条件复制腺病毒 肿瘤基因治疗 单纯疱疹病毒胸苷激酶 -
卵巢癌靶向基因治疗研究进展
卵巢癌死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤之首,基因治疗是治疗卵巢癌的一种新手段.卵巢癌的靶向基因治疗能提高对肿瘤细胞的杀伤作用而不影响正常细胞,是目前研究的热点.载体是基因治疗的关键.目前应用的载体系统主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体.利用卵巢癌的特殊启动子和靶向基因可以提高基因治疗的靶向性.卵巢癌靶向基因治疗的方法主要有:分子化疗、RNA干扰、免疫基因治疗、多药耐药基因治疗和联合基因治疗.卵巢癌的靶向基因治疗目前尚处于临床前实验阶段.
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含AFP启动子腺病毒载体构建的基础研究
[目的]为提高基因治疗载体的靶向性,在现有的溶瘤性腺病毒基础上,应用细菌内同源重组方法构建含AFP启动子和E1A基因的条件复制性腺病毒载体.[方法]应用限制性内切酶以及体外重组技术获取目的片段AFP-AP-IRES-E1Am并进行重组质粒的筛选;将目的片段插入Pshuttle穿梭质粒中;重组的Pshuttle质粒应用PmeI线性化,与含腺病毒骨架DNA、删除了腺病毒E1、E3区的pAdEasy1质粒在BJ5183大肠杆菌细胞中同源重组形成新重组体;抽提重组体DNA,用PacI酶切后,转染至人胚肾细胞株HEk293细胞中进行复制包装,扩增纯化;进行病毒检测.[结果]经用具有Amp抗性及kan抗性的培养板和多种限制性内切酶酶切筛选,证实应用同源重组方法构建了含AFP启动子和目的基因E1A的腺病毒载体;该重组腺病毒可转染HEk293细胞,并进行有效复制.[结论]成功构建了具有特异靶向性的条件复制腺病毒载体,为进一步研究该腺病毒的功能提供了条件.
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含survivin启动子重组的条件复制腺病毒联合顺铂对卵巢癌株HO-8910体外作用的实验研究
目的 观察含survivin启动子的条件复制腺病毒CRAd-survivin-RGD4C联合顺铂对卵巢癌细胞株HO-8910的抑制作用.方法 不同浓度的条件复制腺病毒CRAd-survivin-RGD4C病毒、顺铂以及该病毒联合顺铂体外处理人卵巢癌HO-8910细胞,四甲基偶氮唑蓝比色法检测人卵巢癌HO-8910细胞的生长情况,流式细胞技术检测细胞凋亡. 结果 该腺病毒对肿瘤细胞生长具有明显的抑制效应,并有浓度依赖性,联合化疗可以取得更佳的抑制肿瘤细胞生长的效果.结论 溶瘤病毒联合顺铂治疗卵巢癌可能具有良好的前景.
