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骨髓间充质干细胞与不同基质修饰的纳米晶胶原基骨体外生物相容性研究
研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导培养后与不同基质修饰的纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen,nHAC)的生物相容性,为骨组织工程提供一种新型复合支架材料.SD大鼠MSCs经成骨诱导培养、扩增,进行成骨细胞表征后,种植与支架材料体外复合培养.实验分为4组:实验组A,纤维蛋白(FB)和纤维连接蛋白(FN)修饰的纳米晶胶原基骨((FB+FN)-nHAC);实验组B,纤维蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FB-nHAC);实验组C,纤维连接蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FN-nHAC);对照组D,单纯的纳米晶胶原基骨(nHAC).通过检测支架材料的细胞黏附率、不同时间点(3、7、10、14d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶活性以及扫描电镜观察细胞在材料上的生长状况,比较分析不同支架材料与细胞生物相容性差异.大鼠MSCs经诱导培养14d后,碱性磷酸酶细胞化学染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色及矿化沉积茜素红染色均为阳性;细胞与支架材料黏附率A组高为74.4%;支架材料中细胞数量均随培养时间延长而增长,且A组细胞数增加较快.与相同时相点其他各组材料中细胞数差异有显著性(P<0.05);各时相点细胞碱性磷酸酶活性表达A组高,差异亦有显著性(P<0.05).电镜观察发现4组材料上均有细胞生长,但A组的细胞生长状况明显好于其他组.大鼠MSCs经成骨诱导培养,可表达成骨细胞表型,(FB+FN)-nHAC在体外实验中表现出与细胞优良的生物相容性,可作为较理想的新型复合支架应用于骨组织工程.
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纳米晶胶原基骨在牙槽嵴骨增量手术中的临床应用
目的 探讨纳米晶胶原基骨用于牙种植术中牙槽嵴骨量不足时骨增量的临床效果.方法 对13例行一期牙种植术但存在牙槽嵴骨量不足需要同时进行骨增量手术的患者,采用纳米晶胶原基骨进行骨增量,植入16颗种植体.结果 所有对象愈合期感染率为0%,伤口均一期愈合;6～8个月后X线检查提示种植体周围的骨结合好,16颗种植体均稳固,修复效果良好;骨增量后牙槽嵴平均宽度较术前增加,差异有统计学意义,P<0.05.结论 纳米晶胶原基骨对牙种植术中牙槽嵴骨量不足的患者是一种理想的骨增量修复材料.
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血管内皮生长因子/纳米晶胶原基骨缓释系统与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性
背景:利用载体或缓释系统负载生长因子,既能保护生长因子的生物活性,又可以使生长因子缓慢释放,从而持续促进细胞生长及组织修复再生,是目前控制释放载体材料应用研究的方向之一.目的:观察血管内皮生长因子/纳米晶胶原基骨缓释系统的体外缓释效果及与种子细胞的生物相容性.方法:人骨髓间充质干细胞经体外诱导培养、扩增后种植于血管内皮生长因子+肝素/纤维连接蛋白+纳米晶胶原基骨支架(实验组)和单纯的纳米晶胶原基骨支架(对照组)行体外培养.测定缓释支架材料上血管内皮生长因子的释放量和持续时间;种植细胞后细胞的黏附率;培养3,7,10,14 d时支架材料中细胞数、碱性磷酸酶活性以及细胞在材料上的生长状况.结果与结论:①该缓释支架具有一定的血管内皮生长因子缓释效果,持续时间可达14 d.②第3代人骨髓间充质干细胞经成骨诱导培养,可表达成骨细胞表型:碱性磷酸酶细胞化学染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色均为阳性.③体外实验显示该缓释支架与入骨髓间充质干细胞具有优良的生物相容性:相同时间点实验组的细胞黏附率、支架上细胞数量及细胞碱性磷酸酶活性均明显高于对照组;扫描电镜发现两组材料上均有细胞生长,但实验组的细胞生长状况明显好于对照组.
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骨形态发生蛋白复合支架的体外缓释性能
背景：临床试验证明纳米晶胶原基骨支架材料具有较好的组织相容性、合适的孔隙率及降解性能，但缺乏缓释生长因子的作用，且无成骨诱导性。
目的：将聚乙稀吡咯啉酮与骨形态发生蛋白复合后形成复合颗粒，再修饰纳米晶胶原基骨制备复合支架，观察骨形态发生蛋白的体外缓释效果。
方法：实验分3组，实验组取冻存管2支，每支放入5 mm×5 mm×5 mm 纳米晶胶原基骨1块，滴加聚乙稀吡咯啉酮混匀，-4℃冻存过夜，再滴加骨形态发生蛋白溶液，真空抽干后冻存；对照组1取冻存管2支，每支放入5 mm×5 mm×5 mm 纳米晶胶原基骨1块，滴加骨形态发生蛋白溶液，真空抽干后冻存；对照组2取冻存管2支，每支放入5 mm×5 mm×5 mm未脱钙的大鼠松质骨1块，滴加聚乙稀吡咯啉酮混匀，-4℃冻存过夜，再滴加骨形态发生蛋白溶液，真空抽干后冻存。观察14 d，采用ELISA法检测3组复合物骨形态发生蛋白的体外释放活性。
结果与结论：观察到14 d时，两对照组骨形态发生蛋白A值趋近于0，而实验组上清液中骨形态发生蛋白仍保持较高的A值，组间比较差异有显著性意义(P<0.05)。表明经聚乙烯吡咯烷酮修饰后纳米晶胶原基骨支架具有明显缓释骨形态发生蛋白的作用。 -
应用纳米晶胶原基骨体外构建组织工程骨
目的:应用组织工程技术,建立体外诱导人骨髓间充质干细胞,与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨共培养的人工骨模型,探求细胞与纳米晶胶原基骨结合的佳模式.方法:实验于2005-09/2006-09在江苏大学医学技术学院中心实验室完成.①实验材料:纳米晶胶原基骨材料由清华大学材料系崔福斋等人研制.骨髓取自骨科取髂骨患者(男性,30岁,患者知情同意).②实验干预:全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞并扩增,应用成骨诱导剂诱导向成骨细胞表型转化.取纳米晶胶原基骨材料经60Co照射灭菌,无水乙醇疏水化,三蒸水洗去乙醇等处理制备支架材料.细胞与支架材料复合培养.③实验分组:骨髓间充质干细胞培养至第3代后分为两组:复合材料后加成骨诱导剂组:骨髓间充质干细胞先与纳米晶胶原基骨复合培养3 d后再加入成骨诱导剂;成骨细胞复合材料组:骨髓间充质干细胞在诱导成骨细胞后与纳米晶胶原基骨复合培养.④实验评估:记录第3代骨髓间充质干细胞生长曲线.将诱导后细胞分别进行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色.扫描电镜比较两组复合物经体外孵育2周后,细胞在其中生长情况.结果:①细胞生长情况:倒置显微镜下观察原代培养的骨髓细胞增殖迅速,基本都呈形态均一成纤维样细胞,10～12 d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞7～9 d即可传代.诱导培养后的细胞呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征.构建出骨髓间充质干细胞与骨组织共培养的模型.②体外复合后细胞生长及基质分泌情况:细胞可在纳米晶胶原基骨内表面良好贴壁,复合材料后加成骨诱导剂组,细胞贴附,但成骨细胞少见;成骨细胞复合材料组,细胞数量明显较前者多.复合培养8 d,分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质.第14天,大量细胞在材料表面和孔隙中生长.细胞之间广泛存在突起连接,局部有胶原分泌,且可见成骨细胞形成.结论:证实纳米晶胶原基骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖,经成骨诱导后的细胞较骨髓间充质干细胞更易与材料贴附、增殖.
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血管内皮生长因子缓释系统复合成骨诱导的骨髓间质干细胞修复骨缺损
背景:从目前文献报道来看,生长因子缓释系统在骨科方面的应用研究主要集中在软骨修复方面,关于复合组织工程骨修复骨缺损的研究报道较少.目的:构建复合组织工程骨,观察其修复骨缺损的效果.方法:①通过血管内皮生长因子、肝素和纤维蛋白胶的不同组合构建复合支架缓释系统,经检测选取优组种植成骨诱导的骨髓间质干细胞构建复合组织工程骨.②36只SD大鼠制备股骨干骨缺损模型后随机分为3组,分别植入上述复合组织工程骨和复合支架缓释系统,空白对照组不植入任何材料,3组均予内固定.③ELISA方法检测样本释放的血管内皮生长因子浓度以评价复合支架缓释系统的缓释性能;于植入后1,4,12,24周行X射线检查及骨组织碱性磷酸酶染色评价各组动物骨缺损修复水平.结果与结论:经血管内皮生长因子/肝素/纤维蛋白修饰的纳米晶胶原基骨复合支架缓释系统在体外环境缓释30 d后依然高浓度释放血管内皮生长因子,且缓释曲线平直;动物实验中植入的复合组织工程骨在24周内完全降解,骨缺损修复完成,骨缺损部位碱性磷酸酶活性明显高于复合支架缓释系统组、空白对照组.结果显示该复合支架缓释系统具有优异的缓释性能,在该缓释系统上种植成骨诱导的骨髓间充质干细胞后,能够提高骨缺损修复的速度和质量.
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音猬因子修饰纳米晶胶原基骨复合骨髓间充质干细胞修复股骨缺损
背景:音猬因子作为一种Hedgehog信号蛋白,具有促使骨组织发育、生长及重构等生理功能.目的:观察音猬因子修饰的纳米晶胶原基骨复合骨髓间质干细胞修复大鼠股骨缺损的效果.方法:将48只SD大鼠随机分为4组,均建立股骨缺损模型,造模成功后14 d,实验组于骨缺损处植入音猬因子修饰的纳米晶胶原基骨-骨髓间充质干细胞复合物,支架组于骨缺损处植入纳米晶胶原基骨,细胞支架组植入纳米晶胶原基骨-骨髓间充质干细胞复合物,空白对照组不植入任何材料.修复后3,6,9,12周,进行骨缺损区X射线检查、骨密度及骨组织病理切片观察.结果与结论:①X射线检查:实验组修复后不同时间点的Lane-Sandhu X射线评分、骨密度值均高于其余3组(P<0.05);②苏木精-伊红染色:修复后12周,支架组有少量骨组织形成,无骨髓形成;细胞支架组有少量骨组织形成,无骨髓形成,可见残留支架;实验组植入物完全吸收,成熟骨组织和髓腔形成,腔内有骨髓形成;③扫描电镜观察:修复后12周,支架组有不规则排列的骨纤维和大量骨陷下窝;细胞支架组可见大量成骨细胞,但骨纤维仍然不规则;实验组有大量排列规则的骨小梁,可见哈佛系统;④结果表明:音猬因子修饰的纳米晶胶原基骨复合骨髓间质干细胞可促进骨缺损的修复.
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纳米晶胶原基骨复合骨髓单个核细胞修复下颌骨缺损
背景：纳米晶胶原基骨复合骨髓单个核细胞可促进各种干细胞生长，诱导新骨形成和成血管化，促进终成骨。
目的：探讨骨髓单个核细胞复合纳米晶胶原基骨支架材料修复兔下颌骨缺损的可行性。
方法：选择健康新西兰大白兔27只，制备新西兰大白兔双侧下颌骨人工制备骨缺损模型，分为3组，实验组骨缺损处植入自体骨髓单个核细胞复合纳米晶胶原基骨支架材料，对照组骨缺损处植入纳米晶胶原基骨支架材料，空白组骨缺损处不植入任何材料。术后4，8，12周制备组织标本，行大体观察、影像学分析、苏木精-伊红染色、扫描电镜检测。
结果与结论：影像学检查及组织学染色显示，实验组骨缺损处愈合程度、成骨速度及质量明显优于其他组；扫描电镜显示实验组材料与骨接触紧密，组织相容性好，无炎症刺激反应；分析牙 CT 数据及新骨形成检测结果表明，实验组骨修复情况优于其他组(P<0.05)。表明骨髓单个核细胞复合纳米晶胶原基骨支架材料具有骨诱导和骨形成作用，可用于修复颌骨缺损。 -
血管内皮生长因子与纳米晶胶原基骨支架复合修复大鼠股骨缺损
背景:研究证实纳米晶胶原基骨复合间充质干细胞修复骨缺损具有体内成骨能力.目的:观察血管内皮生长因子与骨髓间充质干细胞、纳米晶胶原基骨复合物修复大鼠股骨缺损的效果.方法:制作SD大鼠股骨中段骨缺损模型,随机分为2组:对照组植入骨髓间充质干细胞/纳米晶胶原基骨复合物;实验组植入血管内皮生长因子/骨髓间充质干细胞/纳米晶胶原基骨复合物.术后第2,4,8周行股骨标本影像学与组织学观察;术后第8周行新生骨痂环境扫描电镜检查.结果与结论:纳米晶胶原基骨支架复合物植入大鼠体内后无排斥反应及炎症反应,且血管内皮生长因子/骨髓间充质干细胞/纳米晶胶原基骨复合物成骨更快,较骨髓间充质干细胞/纳米晶胶原基骨复合物具有更好的骨再生能力,其成骨方式主要为软骨内成骨.推测血管内皮生长因子促进了局部微血管的形成和成骨细胞的分化、增殖,加快了软骨内成骨的速率,缩短了骨修复时间,提高了骨再生的质量和速率.
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骨髓间充质干细胞复合音猬因子/纳米晶胶原基骨修复骨缺损
目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells)复合音猬因子(sonic hedgehog,Shh)修饰的纳米晶胶原基骨(nano Hydroxyapatite/collagen, nHAC)修复大鼠股骨缺损的效果.方法:SD大鼠 MSCs经成骨诱导后,种植于支架材料形成细胞支架复合物.SD大鼠30只制成股骨干5 mm节段性缺损,分为空白对照组:骨缺损处不植植入物,MSCs/nHAC组:植入MSCs/nHAC复合物,MSCs/Shh-nHAC组:植入MSCs/Shh-nHAC复合物.通过大体观察、X线放射学、组织学对比各组骨缺损修复情况.结果:SD大鼠MSCs在体外与nHAC,Shh-nHAC复合培养第7天,电镜扫描证实Shh-nHAC更有利于MSCs黏附、增殖.术后第6、12周放射学检查评价新骨生成各组间差异有统计学意义(P<0.05).术后组织学检查各组新骨生成速度、生成量差异有统计学意义(P<0.05).结论:MSCs/Shh-nHAC复合物能够修复SD大鼠股骨缺损, 修复效果明显优于MSCs/nHAC复合物.
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血管内皮生长因子与细胞支架复合物修复大鼠股骨缺损
目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)与骨髓间充质干细胞(MSCs)、纳米晶胶原基骨(nHAC)复合物对大鼠股骨缺损的修复作用.方法:将20只SD大鼠制成股骨缺损模型后分2组:对照组植入MSCs/nHAC复合物,实验组植入VEGF/MSCs/nHAC复合物.术后第2,4,8周行影像学和组织学观察;术后第8周行新生骨痂环境扫描电镜(ESEM)检查.结果:术后第2,4,8周实验组与对照组放射学检查评价骨生成差异有统计学意义(P<0.05).组织学观察发现实验组较对照组能更快更有效地促进大鼠股骨缺损处的骨痂生长.结论:VEGF/MSCs/nHAC支架较MSCs/nHAC支架对骨缺损的修复有更好的效果.
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表面修饰对纳米晶胶原基骨细胞相容性的影响
目的:探索纤维蛋白(fibrin,FB)修饰的纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen,nHAC)支架材料上成骨诱导的骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)黏附、增殖及分化的情况.方法:实验分为两组:实验组,纤维蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FB-nHAC);对照组,单纯的纳米晶胶原基骨(nHAC).将SD大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导为成骨细胞,种植于支架材料上,体外复合培养.通过检测支架材料的细胞黏附率、不同时间点(3,7,10,14 d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶表达量以及扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长状况,比较分析不同支架材料与细胞生物相容性差异.结果:大鼠MSCs经诱导培养14 d后,I型胶原免疫荧光染色为阳性;实验组支架材料的细胞黏附率显著高于对照组(P<0.05);且相同时间点实验组支架材料中的细胞数及碱性磷酸酶表达量也明显高于对照组(P<0.05);电镜观察发现两组材料上均有细胞生长,但实验组的细胞生长状况明显好于对照组.结论:表面修饰纤维蛋白后的nHAC支架材料具有更好的细胞黏附、增殖及促成骨分化能力.
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纳米晶胶原基骨和羟基碱石灰在牙槽嵴骨量不足治疗中的应用
目的 探讨纳米晶胶原基骨和羟基碱石灰在牙槽嵴骨量不足患者牙种植术治疗中的临床疗效.方法 选择应用纳米晶胶原基骨和羟基磷灰石治疗牙槽嵴骨量不足的牙种植术患者为研究对象,根据入院先后随机分为纳米晶胶原基骨组和羟基碱石灰组,对比分析两种方法治疗牙槽嵴骨量不足的临床疗效.结果 纳米晶胶原基骨组临床痊愈率明显高于羟基磷灰石组(p＜0.05).羟基磷灰石组与纳米晶胶原基骨组骨增量后牙槽嵴平均宽度均较术前明显增加(P＜0.01).两组治疗后差异无统计学意义(P＞0.05).结论 纳米晶胶原基骨治疗牙种植术牙槽嵴骨量不足疗效满意,值得临床进一步研究推广.
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交锁髓内钉固定联合nHAC-BMP复合物植入治疗股骨干骨折术后骨不连68例
目的 观察交锁髓内钉固定联合nHAC-BMP复合物植入治疗股骨干骨折术后骨不连的效果.方法 股骨干骨折术后骨不连患者68例,采用交锁髓内钉固定,术中取纳米晶胶原基骨(nHAC)-骨形态发生蛋白(BMP)复合物植入断端,观察骨折愈合情况及骨折断端骨细胞生长状况.结果 术后第6个月,X线片显示所有患者骨折均愈合.术后第4周,骨折端nHAC降解成网孔状,骨折端内有大量骨细胞生成;术后第3个月,骨折端nHAC全部降解成网孔状,骨折端破损部位有大量新生细胞生成;术后第6个月,骨折部位全部愈合.结论 交锁髓内钉固定联合nHAC-BMP复合物植入治疗股骨干骨折术后骨不连骨折愈合率高.
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纳米晶胶原基骨与自体骨颗粒修复糖尿病节段性骨缺损临床观察
外伤导致粉碎性骨折后常常引起节段性骨缺损,当骨缺损达到一定距离后即不能产生骨性愈合,尤其是糖尿病患者因为骨质疏松多见,外伤粉碎性骨折后的节段性骨缺损的修复和愈合更是骨科修复领域中一个棘手的问题.因此本研究旨在探讨纳米晶胶原基骨与自体骨颗粒修复糖尿病节段性骨缺损的临床疗效.现报告如下.
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人骨髓间充质干细胞接种纳米晶胶原骨构建组织工程骨
目的 观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨(nano-hydroxyapatitc/collagen,nHAC)的生物相容性及细胞在nHAC上的生长情况.方法 全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞,应用成骨诱导剂诱导向成骨细胞表型转化,通过细胞活性、免疫组化鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性.通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在nHAC上的生长情况.结果 原代培养的骨髓细胞增殖迅速,10～12d左右即可稳定传代,传代细胞7～9d即可传代.经诱导培养的细胞的ALP染色阳性,Von Kossa染色阳性,可见钙化的基质沉积,呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征.构建的MSCs与nHAC共培养的模型中,细胞可在nHAC表面良好贴壁.复合培养8天,分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质.第14天,大量细胞在材料表而和孔隙中生长.细胞之间广泛存在突起连接.结论 nHAC适合种子细胞的贴附、生长和增殖,是组织工程良好的载体材料.
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纳米晶胶原基骨和骨髓间充质干细胞复合修复兔股骨头坏死缺损的研究
目的探讨采用纳米晶胶原基骨(nano-hydroxyapatite collagen,nHAC)和骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)复合材料修复兔股骨头坏死骨缺损的可行性. 方法 2004年6月～10月,取45只成年新西兰大白兔制成双侧股骨头内骨缺损模型,随机分为3组进行修复,A组:骨缺损不填充任何材料;B组:骨缺损填充单纯nHAC;C组:骨缺损填充nHAC与MSCs的复合材料.术后3组分别于4、8和12周对股骨头行影像学和组织学观察. 结果影像学和组织学显示C组复合材料有良好的诱导成骨能力,术后4周即有明显的成骨反应和新骨形成,12周基本修复股骨头的骨缺损区;B组材料修复能力较C组差,但B组和C组均优于A组.B组和C组对nHAC无明显异物反应. 结论 nHAC有较强的传导成骨作用,是修复兔股骨头骨缺损的良好移植材料;复合MSCs后能促进骨缺损的修复,对股骨头坏死的治疗有较大价值.
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纳米晶胶原基骨加自体骨移植治疗早期股骨头坏死的临床疗效分析
目的 回顾性分析经股骨头颈交界处开窗、灯泡状病灶清除、打压植骨术结合纳米晶胶原基骨和自体骨移植治疗早期股骨头坏死(osteonecrosis offemoral head,ONFH)的临床疗效. 方法 2001年1月-2005年7月,收治26例35髋ONFH患者,男16例,女10例;年龄19～54岁,平均33.5岁.病程12～36个月,平均18个月.ONFH病因:激素性15例22髋,酒精性10例12髋,特发性1例1髋.ARCO分期:Ⅱ B期6髋,Ⅱ C期16髋,ⅢA期9髋,Ⅲ B期3髋,ⅢC期1髋.Harris评分为(62.2±7.5)分.术中采用经股骨头颈交界处开窗、灯泡状病灶清除,按1:l比例行纳米晶胶原基骨和自体骨移植治疗. 结果 患者术后切口均I期愈合.术中2例髂骨取骨伤及股外侧皮神经,术后3～6个月神经支配区麻木症状自行缓解消失:2例术后3个月出现异位骨化并发症,未行特殊处理.患者均获随访,随访时间2～7年,平均3.5年.术后3个月患者植骨愈合.术后Harris评分为(85.1±16.2)分,与术前比较差异有统计学意义(P<0.001).其中优15髋,良11髋,可5髋,差4髋.获差的4例患者均于随访期末行全髋关节置换术.影像学检查示5髋由术前Ⅱ C期进展至ⅢA期;余髋关节影像学表现稳定,ONFH分期无进展. 结论 经股骨头颈交界处开窗、灯泡状病灶清除、打压植骨术,结合纳米晶胶原基骨和自体骨移植治疗早期ONFH临床效果满意,纳米晶胶原基骨有利于骨坏死的修复和重建,适于Ⅱ期ONFH的患者保存股骨头手术.
