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ANO1、EGFR在食管上皮异型增生组织和癌变进程中的表达及其意义
目的 比较钙离子激活氯离子通道蛋白1 (anoctamin 1,ANO1)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白在小鼠不同食管上皮组织病变中的表达,探讨ANO1、EGFR蛋白表达与小鼠食管上皮病变的关系,为早期食管癌变诊断提供参考. 方法 应用化学致癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)由饮水法建立小鼠食管癌前病变模型,HE染色光镜下比较观察食管正常组织、轻度、中度、重度异型增生组织及癌变组织变化,采用免疫组化法检测小鼠食管不同病变组织中EGFR、ANO1蛋白表达情况. 结果 至实验第24周末,共收集小鼠食管正常组织14份、异型增生组织23份(其中轻度异型增生7份、中度异型增生8份、重度异型增生8份)、癌变组织18份.其中ANO1和EGFR蛋白在食管轻度异型增生组织、中度异型增生组织和正常组织中的阳性率分别为0(0/7)、12.50％(1/8)、0(0/14)和14.29％(1/7)、12.50％(1/8)、7.14％(1/14),差异均无统计学意义(P＞0.05);ANO1和EGFR在癌组织中的阳性率分别为55.56％(10/18)和61.11％(11/18),与ANO1和EGFR在异型增生组织(轻度、中度和重度增生组织)中的阳性率17.39％(4/23)和26.09％(6/23)及其正常组织中的阳性率0(0/14)和7.14％(1/14)比较差异有统计学意义(P＜0.05);ANO1和EGFR在重度异型增生组织中的阳性率分别为37.50％(3/8)和50％(4/8),与正常组织比较差异有统计学意义(P＜0.05).在18份食管癌组织中,ANO1阳性组EGFR阳性率90％(9/10),ANO1阴性组EGFR阴性率75％(6/8),两种蛋白的表达呈正相关(r=0.663,P=0.003). 结论 ANO1、EGFR蛋白在小鼠食管癌组织及重度异型增生上皮组织中存在过表达,且两种蛋白在食管癌组织中的表达呈正相关,提示ANO1和EGFR两者有可能成为食管癌早期诊断的生物学标志物.
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以ANO1蛋白为靶点的钙激活氯通道调节剂研究进展
钙激活氯通道是广泛存在于人体内的一种阴离子通道,参与分泌、心肌细胞去极化、神经信号传导等多种生理活动.ANO1蛋白是钙激活氯通道的分子基础之一,对ANO1蛋白进行调节能够产生多种药效作用,例如镇痛、治疗痢疾、哮喘、抑制肿瘤等.近10年来发展出许多ANO1蛋白调节剂筛选测试方法,虽然筛选出一系列以ANO1蛋白为靶点的钙激活氯通道调节分子,但是这些分子的药理学作用却并不一致.本文从筛选方法、构效关系、潜在应用前景等多方面对ANO1蛋白调节分子的研究进展进行论述.
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稳定高表达ANO1对Hep-2细胞生物学性状的影响
目的:建立外源性ANO1稳定高表达的Hep-2细胞株,并观察其对Hep-2细胞生物学性状的影响.方法:设计引物,提取头颈鳞癌患者的临床标本DNA,并以其为模板行PCR,得到ANO1基因序列片段,将ANO1片段插入到PSG-5质粒,转染入Hep-2细胞株,将稳定高表达ANO1的Hep-2细胞株设为实验组,空白质粒转染的Hep-2细胞株设为对照组.并利用Western blotting法和免疫荧光实验检测已转染细胞,观察ANO1的表达情况.利用Boyden小室侵袭实验和黏附实验检测Hep-2细胞生物学性状的变化.结果:成功构建含ANO1片段的pSG-5质粒,Western blotting法检测结果显示,各组均出现目的条带,实验组的相对分子质量为100 000处条带明显较浓.间接免疫荧光实验结果显示,稳定高表达ANO1的Hep-2细胞内显现出亮绿色荧光,而空白质粒转染的Hep-2细胞内仅有较暗、较浅的绿色荧光.Boyden小室侵袭实验和黏附实验结果显示,稳定高表达ANO1的Hep-2细胞穿膜细胞百分比和黏附细胞百分比均明显高于对照组,两组结果比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:成功建立了ANO1稳定高表达的Hep-2细胞株,稳定高表达ANO1提高了Hep-2细胞的迁移能力.
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增强型绿色荧光蛋白融合对Ano1钙激活Cl-通道生理特性的影响
本研究旨在探讨融合在Ano1钙激活Cl-通道(anoctamin1)C末端的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对Ano1生理特性的影响.分别构建融合和未融合EGFP的Ano1真核表达载体,通过脂质体介导分别将这两类真核表达载体转染至Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞,倒置荧光显微镜下观察融合和未融合EGFP的Ano1在FRT细胞中的表达与定位;荧光淬灭动力学检测Ano1转运I-的能力.结果显示,融合和未融合EGFP的Ano1均表达于FRT细胞膜上,且均能被Ca2+激活,融合和未融合EGFP的Ano1转运I-的能力无明显差异.以上结果提示,Ano1和EGFP-Ano1具有相似的生理特性.
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ANO1对非小细胞肺癌病理分期和复发的影响
目的 探讨anoctamin 1(ANO1)表达对非小细胞肺癌(NSCLC)病理分期和复发的影响.方法 Ⅰ-Ⅲ期NSCLC患者64例.采用qRT-PCR、Western blot和免疫组化检测肺癌组织和癌旁组织ANO1和表皮生长因子受体(EGFR)的表达;行肿瘤病理分级评定,随访术后的复发.结果 NSCLC存在ANO1的过表达.ANO1阳性组28例中,26例(93％)的EGFR表达阳性;ANO1阳性组的病理Ⅲ期病例的比例高于ANO1阴性组(50％ vs.17％) (P＜0.01).随访1年,ANO1阳性组的复发率高于ANO1阴性组(39％ vs.17％)(P＜0.01).结论 ANO1在NSCLC组织存在过表达.ANO1的过表达促进EGFR的过表达,提高NSCLC的病理分级评分和复发率.
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ANO1稳定高表达对Hep-2细胞株生物学特性的影响
目的：检测ANO1高表达对Hep-2细胞株生物学特性的影响。方法利用ANO1稳定高表达的Hep-2细胞株先后进行流式细胞仪，软琼脂细胞生长实验，体外划痕愈合实验，SiRNA实验，SiRNA沉默ANO1的体外划痕愈合实验，DIDS阻断氯离子通道实验，以明确ANO1高表达对Hep-2细胞株生长、迁移及侵袭的影响。结果流式细胞仪检测细胞周期，结果显示实验组和空白组的G0/G1期比率差异无显著性（P>0.05）；软琼脂细胞生长实验结果显示实验组和对照组差异无显著性（P>0.05）；体外划痕愈合实验结果显示两者差异有显著性（P<0.05），表明ANO1高表达加快了Hep-2细胞的迁移速度；SiRNA沉默ANO1的体外划痕愈合实验结果显示两者差异有显著性（P<0.05），表明沉默ANO1可减缓Hep-2细胞的迁移速度。DIDS阻断氯离子通道实验结果显示两者差异有显著性（P<0.05），表明DIDS能有效的阻断ANO1的氯离子通道活性，并且减缓Hep-2细胞的迁移速度，再一次证明ANO1参与了Hep-2细胞的迁移活动。结论 ANO1高表达并未改变癌细胞的增殖速度，但却大大增加了头颈鳞癌细胞的移动能力，有望成为治疗头颈鳞癌的新靶点。
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ANO1蛋白在食管鳞状细胞癌中表达的瘤内异质性
目的:探讨ANO1蛋白在食管鳞状细胞癌组织中表达的瘤内异质性及与肿瘤临床病理学特征的关系.方法:采用组织微阵列免疫组化法检测122例食管鳞癌每例4个肿瘤取材区域及相应正常组织中ANO1蛋白的表达情况,比较每例肿瘤不同取材区域的表达差异,分析ANO1蛋白表达情况与患者临床病理学特征的相关性.结果:ANO1蛋白在所有正常组织中呈阴性表达,而在肿瘤组织的表达阳性率为53.3％(65/122).统计学分析显示,ANO1蛋白的表达情况在有、无淋巴结转移之间及不同肿瘤临床分期之间存在显著性差异(P＜0.05).在阳性表达的病例中,绝大多数(55/65)肿瘤内显示不同程度的ANO1蛋白表达异质性,其中32.3％(21/65)的病例存在不同取材区域之间较大的异质性.结论:ANO1蛋白在正常组织中呈阴性表达,在食管鳞状细胞癌组织中呈部分阳性表达,与临床病理学参数存在显著相关性(P＜0.05).而且,食管鳞状细胞癌ANO1蛋白表达存在明显的瘤内异质性,多位点取材有助于提高ANO1表达的检出率并可减少漏检.
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不同抗原修复方法对食管鳞癌组织中ANO1蛋白染色的影响
目的:探讨不同修复条件及修复液对食管鳞癌组织中ANO1的阳性表达程度的影响,筛选优势抗原修复方法.方法:对30例食管鳞癌组织的石蜡切片分别采用高压-枸橼酸缓冲液修复法、高压-EDTA缓冲液修复法、微波-枸橼酸缓冲液修复法及微波-EDTA缓冲液修复法进行修复,检测ANO1蛋白免疫组化染色效果.结果:食管鳞癌组织中ANO1蛋白经高压-枸橼酸缓冲液修复后,着色强度较其他修复方法明显增强,且阳性定位准确、对比度清晰,极大降低免疫组化背景着色.结论:在ANO1蛋白免疫组织化学染色中,高压-枸橼酸缓冲液修复法优于其他抗原修复方法.
