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Ubc9对鸡胚神经嵴细胞发育的影响
目的 探索Ubc9和SUMO通路对鸡胚神经嵴细胞发育的影响.方法 1)采集鸡胚,通过免疫荧光实验和原位杂交实验来检测SUMO结合酶Ubc9及神经嵴细胞标志基因的表达情况.2)设置对照组(非特异性吗啉代处理)和Ubc9-吗啉代组来处理各组8期鸡胚,随后通过原位杂交实验检测Snail2,Sox9和FoxD3等神经嵴细胞晚期标志基因的表达情况.结果 1)Ubc9与标志基因Pax7共表达于4、6和8期鸡胚神经嵴细胞前体.2)与对照组相比,Ubc9-吗啉代组鸡胚单侧上Snail2(P＜0.05),Sox9(P ＜0.01)和FoxD3(P＜0.05)的mRNA水平均有下降.结论 Ubc9表达于4、6和8期鸡胚的神经脊细胞前体,鸡胚神经嵴细胞的形成需要SUMO通路参与.
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慢病毒介导的敲低UBC9表达抑制ERβ类泛素化修饰水平
目的 建立稳定敲低UBC9蛋白表达的293T细胞株,检测其对雌激素受体β(ERβ)类泛素化修饰水平的调节作用.方法 构建4条针对人UBC9基因的慢病毒短发夹RNA(shRNA)的干扰载体,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后,收集病毒上清,感染293T细胞,经嘌呤霉素(puromycin)筛选后获得稳定表达慢病毒介导UBC9 shRNA的混合细胞集落,分别用实时(real-time) PCR和Western印迹方法检测UBC9的表达情况,瞬时转染方法检测UBC9表达水平对ERβ类泛素化修饰水平的影响.结果 建立了稳定敲低UBC9的293T细胞株,UBC9降低能够抑制ERβ类泛素化修饰水平.结论 UBC9在ERβ类泛素化修饰反应中发挥重要作用.
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过表达Ubc9酶对乳大鼠心肌细胞低氧损伤的保护作用
目的 探讨类泛素样修饰蛋白(SUMO)修饰中的泛素缀合酶类E2I(Ubc9)对体外乳大鼠心肌细胞(NRCM)急性低氧损伤的作用及其可能的机制.方法 采用分离纯化细胞法培养NRCM,对NRCM分别转染5,10,20,50和100感染指数(moi)的纯化的大鼠Ubc9基因腺病毒(Adv-Ubc9),转染48 h后在荧光显微镜下分别观察其绿色荧光蛋白(GFP)的荧光强度,并用Western印迹法检测转染效率.NRCM行氧葡萄糖剥夺(OGD)分别处理0,2,4,6,12和24 h后,Western印迹法检测Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、自噬相关蛋白P62/SQSTM1(P62)和微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达.NRCM转染Adv-Ubc950 moi 48 h,使得Ubc9过表达,随后OGD处理6 h,建立心肌细胞急性低氧模型,利用原位末端转移酶标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡,Western印迹法检测Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、P62、LC3和类泛素化修饰蛋白1(SUMO-1)的表达水平,蛋白免疫共沉淀法检测Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平.NRCM转染Ubc9的小干扰RNA(Ubc9-siRNA)48 h,使Ubc9沉默,随后行OGD处理6 h,Western印迹法检测活化的胱天蛋白酶3的表达水平.NRCM给予巴伐洛霉素A1(BFA1)50 nmol·L-1作用2 h,Western印迹法检测LC3表达水平.结果Adv-Ubc9在50与100 moi时转染成功且效率一致,与单纯OGD组相比,过表达Ubc9能明显降低OGD引起的心肌细胞凋亡(P<0.01)、降低活化的胱天蛋白酶3的表达(P<0.01),而沉默Ubc9使心肌细胞OGD处理后的活化的胱天蛋白酶3表达上调(P<0.05),说明过表达Ubc9能抵抗OGD引起的心肌细胞凋亡.与正常对照组相比,OGD处理后,自噬底物P62发生堆积(P<0.01),自噬蛋白LC3Ⅱ明显下调(P<0.05),自噬流出现障碍;当过表达Ubc9后能明显逆转OGD引起的自噬底物P62堆积(P<0.05),改善自噬流障碍,但对自噬蛋白LC3Ⅱ影响不明显.在此基础上给予BFA1阻断自噬体与溶酶体融合过程后,与OGD+BFA1组相比,Adv-Ubc9+OGD+BFA1组的LC3Ⅱ表达明显上调(P<0.01),提示Ubc9改善自噬流障碍的作用可能与同时促进自噬激活和自噬降解过程有关;蛋白免疫共沉淀结果显示,与正常对照组相比,OGD处理后SUMO-1蛋白表达水平基本无变化,而过表达Ubc9后,SUMO-1蛋白表达明显上调(P<0.01),OGD处理后,Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平下调(P<0.01),而过表达Ubc9后,Vps34和Beclin1的SUMO化修饰明显上调(P<0.01),说明过表达Ubc9可能通过提高与自噬激活和自噬降解过程均相关的Vps34和Beclin1的SUMO化修饰,从而同时促进自噬激活和自噬降解过程改善OGD后的自噬流障碍,进而抵抗OGD引起的心肌细胞凋亡.结论 高表达Ubc9酶能显著抑制OGD导致的心肌细胞凋亡,该保护作用可能是增强了Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平,从而同时促进自噬激活(形成自噬体)和自噬降解(自噬体与溶酶体融合)过程,进而改善OGD后自噬流障碍.
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调节Ubc9基因对卵巢癌细胞侵袭和迁移的影响
目的 探讨调节Ubc9基因对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响,探讨其作用机制.方法 应用体外Transwell细胞侵袭实验检测调节Ubc9基因对卵巢癌HO8910细胞侵袭能力影响,以稳定转染Ubc9的HO8910-Ubc9细胞为Ubc9组,对照组为未转染的HO8910细胞(normal)及转染空质粒的HO8910细胞(vector);另以转染Ubc9特异性siRNA的HO8910-Ubc9细胞为siRNA1、siRNA2组,对照组为未被Ubc9特异性siRNA转染HO8910-Ubc9细胞(normal)及转染无关序列RNA的HO8910-Ubc9细胞(negative control).应用划痕实验观察调节Ubc9基因对卵巢癌HO8910细胞迁移能力的影响.结果 HO8910-Ubc9组穿过Matrigel胶的细胞数量明显高于空白对照组和空质粒组(P＜0.05),Ubc9-siRNAs转染48h后,HO8910-Ubc9细胞穿过人工基底膜的细胞数目明显低于对照组(P＜0.05).HO8910-Ubc9细胞在6、12、24h愈合率明显高于HO8910组(P＜0.05),转染Ubc9-siRNA的HO8910-Ubc9细胞于划痕后在24h,细胞愈合率明显低于对照组(P＜0.05).结论 Ubc9促进HO8910细胞侵袭、迁移,可能成为临床治疗的新靶点.
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SUMO化结合酶Ubc9与肿瘤关系的研究进展
Ubc9是目前发现的SUMO化途径中唯一的E2结合酶,在蛋白SUMO化的过程中起到重要作用.经研究证实,在人的多种肿瘤中Ubc9过表达,Ubc9在肿瘤的发生发展中起到重要的作用,因而它有可能成为癌症治疗的靶点.本文着重阐述Ubc9与肿瘤发生发展之间的关系,并探讨Ubc9蛋白阻断剂与抑制剂在肿瘤治疗中的进展.
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UBC9在人肺癌组织中高表达及其临床意义
目的:由于Ubc9在肿瘤的发生于恶化中发挥巨大作用,本研究目的是对泛素结合酶(Ubc9) mRNA和Ubc9蛋白在非小细胞肺癌组织中表达进行检测,评估Ubc9在肺癌预后中的指导意义.方法:通过荧光定量PCR、免疫组织化学法、Western-blot检测100例非小细胞肺癌病人中Ubc9 mRNA、蛋白水平的表达进一步研究Ubc9的表达与肺癌临床特征的关系.结果:实验结果显示在肺癌细胞中Ubc9阳性表达显示为黄棕色颗粒,与癌旁组织比较,Ubc9 mRNA、蛋白在肺癌组织中高表达,并且与肺癌的临床分型(分期、淋巴结转移、吸烟、分化)有关.Ubc9 mRNA、蛋白在肺癌中的表达癌组织高于癌旁、有淋巴结转移的高于无转移、吸烟高于不吸烟者、低分化组织高于高分化组织.结论:由此可见Ubc9 mRNA、蛋白水平的高表达可能对肺癌临床特征的评估,以及预测术后生存率都有重要指导意义.
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类泛素缀和酶9在肝纤维化中的作用及机制
目的 研究类泛素缀和酶9(UBC9)在肝星状细胞的激活及肝纤维化中的作用机制.方法 通过蛋白印记法(Western blot)检测UBC9在不同浓度的转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激下的肝星状细胞LX-2中的表达情况;构建UBC9质粒干扰片段(UBC9-shRNA),采用脂质体介导转染LX-2,同时设置无义序列组和空白对照组,实时荧光定量PCR检测转染后UBC9 mRNA的表达;Western blot检测UBC9在蛋白水平的表达;Western blot检测下调UBC9对α-SMA、Collagen I及磷酸化的Smad3表达的影响.CCK8检测转染后细胞增殖能力.结果 UBC9在TGF-β1因子刺激下的肝星状细胞LX-2表达增加,一定剂量下呈浓度依赖性.转染干扰片段UBC9-shRNA后,激活的LX-2细胞增殖减弱,α-SMA和Collagen I蛋白的表达减少,而且下调UBC9也能抑制磷酸化的Smad3的表达.结论 下调UBC9可以通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路进而影响肝星状细胞LX-2的激活,这些都提示UBC9在肝纤维化过程具有重要作用,为肝纤维化治疗提供一些新的理论依据.
关键词： 肝纤维化 Ubc9 肝星状细胞 TGF-β1/Smad3信号通路 -
同源异型盒基因HOXA5抑制肝癌的侵袭和迁移通过调控UBC9的表达
目的:检测人肝癌及癌旁组织中HOXA5基因的表达情况,观察稳定高表达HOXA5基因的肝癌细胞MHCC97H迁移和侵袭能力的变化,探讨HOXA5调控肝癌侵袭迁移的机制,为肝癌的分子靶向治疗提供新的靶点.方法:通过实时定量PCR (qRT-PCR)、Western blot以及免疫组织化学等技术检测肝癌及癌旁组织中HOXA5基因的表达.构建稳定高表达HOXA5的肝癌细胞MHCC97H,利用划痕和Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力的变化.应用CHIP-Seq筛选出HOXA5潜在的靶基因,在稳定高表达HOXA5基因细胞中应用qRT-PCR、Western blot验证HOXA5与靶基因的关系.结果:新鲜的肝癌组织以及相对应的癌旁组织中,免疫组织化学显示相比于癌旁组织的表达情况,肝癌组织中HOXA5的表达低于癌旁;qRT-PCR、Western blot检测发现相对于癌旁组织,肝癌组织中HOXA5的表达水平显著下调.过表达了HOXA5基因的MHCC97H细胞的侵袭能力下降.CHIP-Seq的结果发现,HOXA5结合在UBC9的上游启动子区域.在稳定高表达HOXA5的MHCC97H细胞中,UBC9的mRNA和蛋白表达均下调.当在稳定高表达HOXA5的同时过表达UBC9时,肝癌细胞的侵袭和迁移能力部分回复.结论:在肝癌组织中HOXA5的表达下调;UBC9介导了HOXA5抑制肝癌细胞侵袭迁移的作用,这为进一步阐明肝癌发生侵袭转移过程中的分子机制提供一个新的思路,为精准治疗肝癌提供一个可能的靶点.
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真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达
目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达.方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达.结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9.
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Ubc9在肺癌组织中的表达及意义
目的：探讨Ubc9在人肺癌组织中的表达及临床意义。方法：应用免疫组织化学法和实时荧光定量PCR（ real time quantitative PCR，RT-qPCR）法检测143例肺癌组织及同源非癌变组织中Ubc9的表达情况，并对临床病理资料进行分析。结果：与癌旁组织相比，Ubc9在肺癌组织中呈高表达（ P<0.05），Ubc9的表达与年龄、淋巴结转移、TNM分期及预后密切相关，有统计学意义（ P<0.05）；而与性别、病理学类型、组织分化程度无关。结论：小细胞肺癌、肺鳞癌和肺腺癌中均有Ubc9阳性表达，均高于正常的肺组织，并且与肺癌淋巴结转移程度相关，提示Ubc9可能与肺癌细胞的转移特性有关。
