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氧葡萄糖剥夺-再恢复小鼠小胶质细胞的激活及Toll样受体9表达的变化
目的 观察氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)对小鼠BV-2小胶质细胞的激活以及Toll样受体9(TLR9)表达的影响 方法 采用OGDR法建立BV-2细胞缺氧、缺糖模型,以常氧培养的BV-2细胞作为对照.使用倒置相差显微镜观察BV-2细胞在OGDR后0、6、12、24、48、72h形态的变化,CCK8法检测OGDR后不同时间点细胞存活率的变化,反转录PCR和Western Blot检测细胞内TLR9 mRNA和蛋白的表达. 结果 ①OGDR后BV-2细胞由原来静止的分枝状变成激活的阿米巴状.②OGDR后,细胞存活率明显下降,0h为对照组的(65.7±9.2)％；12 h下降至低,为对照组的(44.8±2.3)％,后逐渐升高,48、72 h分别为对照组的(60.8±10.2)％、(72.3±10.0)％.③OGDR后,随着时间的延长,TLR9 mRNA表达逐渐升高,24h达高峰,后逐渐降低,但72 h仍高于0h时间点的表达.TLR9蛋白表达亦呈升高趋势,在72h达高峰.对照组各时间点TLR9 mRNA、TLR9蛋白表达差异均无统计学意义.④相同时间点的比较,OGDR组OGDR后6～72h,TLR9 mRNA表达均明显高于对照组(P＜0.05,或P＜0.01,)；12～72h,TLR9蛋白表达显著高于对照组(P＜0.05,或P＜0.01). 结论 OGDR后BV-2细胞被激活,其细胞内TLR9表达随着时间的延长逐渐增高,可能在脑缺血-再灌注后的炎性反应中,发挥重要作用.
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过表达Ubc9酶对乳大鼠心肌细胞低氧损伤的保护作用
目的 探讨类泛素样修饰蛋白(SUMO)修饰中的泛素缀合酶类E2I(Ubc9)对体外乳大鼠心肌细胞(NRCM)急性低氧损伤的作用及其可能的机制.方法 采用分离纯化细胞法培养NRCM,对NRCM分别转染5,10,20,50和100感染指数(moi)的纯化的大鼠Ubc9基因腺病毒(Adv-Ubc9),转染48 h后在荧光显微镜下分别观察其绿色荧光蛋白(GFP)的荧光强度,并用Western印迹法检测转染效率.NRCM行氧葡萄糖剥夺(OGD)分别处理0,2,4,6,12和24 h后,Western印迹法检测Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、自噬相关蛋白P62/SQSTM1(P62)和微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达.NRCM转染Adv-Ubc950 moi 48 h,使得Ubc9过表达,随后OGD处理6 h,建立心肌细胞急性低氧模型,利用原位末端转移酶标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡,Western印迹法检测Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、P62、LC3和类泛素化修饰蛋白1(SUMO-1)的表达水平,蛋白免疫共沉淀法检测Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平.NRCM转染Ubc9的小干扰RNA(Ubc9-siRNA)48 h,使Ubc9沉默,随后行OGD处理6 h,Western印迹法检测活化的胱天蛋白酶3的表达水平.NRCM给予巴伐洛霉素A1(BFA1)50 nmol·L-1作用2 h,Western印迹法检测LC3表达水平.结果Adv-Ubc9在50与100 moi时转染成功且效率一致,与单纯OGD组相比,过表达Ubc9能明显降低OGD引起的心肌细胞凋亡(P<0.01)、降低活化的胱天蛋白酶3的表达(P<0.01),而沉默Ubc9使心肌细胞OGD处理后的活化的胱天蛋白酶3表达上调(P<0.05),说明过表达Ubc9能抵抗OGD引起的心肌细胞凋亡.与正常对照组相比,OGD处理后,自噬底物P62发生堆积(P<0.01),自噬蛋白LC3Ⅱ明显下调(P<0.05),自噬流出现障碍;当过表达Ubc9后能明显逆转OGD引起的自噬底物P62堆积(P<0.05),改善自噬流障碍,但对自噬蛋白LC3Ⅱ影响不明显.在此基础上给予BFA1阻断自噬体与溶酶体融合过程后,与OGD+BFA1组相比,Adv-Ubc9+OGD+BFA1组的LC3Ⅱ表达明显上调(P<0.01),提示Ubc9改善自噬流障碍的作用可能与同时促进自噬激活和自噬降解过程有关;蛋白免疫共沉淀结果显示,与正常对照组相比,OGD处理后SUMO-1蛋白表达水平基本无变化,而过表达Ubc9后,SUMO-1蛋白表达明显上调(P<0.01),OGD处理后,Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平下调(P<0.01),而过表达Ubc9后,Vps34和Beclin1的SUMO化修饰明显上调(P<0.01),说明过表达Ubc9可能通过提高与自噬激活和自噬降解过程均相关的Vps34和Beclin1的SUMO化修饰,从而同时促进自噬激活和自噬降解过程改善OGD后的自噬流障碍,进而抵抗OGD引起的心肌细胞凋亡.结论 高表达Ubc9酶能显著抑制OGD导致的心肌细胞凋亡,该保护作用可能是增强了Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平,从而同时促进自噬激活(形成自噬体)和自噬降解(自噬体与溶酶体融合)过程,进而改善OGD后自噬流障碍.
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低氧预适应诱导C6细胞对氧葡萄糖剥夺的耐受
目的: 研究低氧预适应诱导神经胶质细胞瘤细胞(C6 Glioma Cells,简称C6细胞)对氧葡萄糖剥夺(OGD)的耐受及其机制.方法: C6细胞通过低氧(1%)预处理,在经受OGD打击后,观测其对细胞活力的影响.利用Western blot分析低氧预适应对C6细胞磷酸化-ERK(p-ERK)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和红细胞生成素(EPO)蛋白的影响;通过PD98059和LY294002的使用,分析低氧诱导C6细胞预适应现象与MEK/ERK通路的关系.结果: 低氧能诱导细胞预适应的发生,而且对于24 h的OGD,有效的低氧预适应时间为16 h;低氧能诱导细胞p-ERK信号蛋白的上调,激活HIF-1α和增加EPO的表达,且能被PD98059所抑制.结论: 低氧预适应能增强C6细胞对24 hOGD的耐受,产生预保护作用,其中以低氧预适应16 h效率高;MEK/ERK信号转导途径参与了低氧预适应作用;低氧预适应可通过激活HIF-1α和增加EPO表达水平来实现.
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钾通道阻断剂四乙铵对氧葡萄糖剥夺诱导大鼠海马神经元死亡的保护作用
目的 研究钾通道阻断剂四乙铵(TEA)对氧葡萄糖剥夺(OGD)诱导的培养海马神经元死亡的保护作用.方法 培养12 d的海马神经元培养基更换为Earle's 平衡盐溶液(EBSS)后置于37℃三气缺氧(N2:CO2:O2=94%:5%:1%)培养箱内培养,4 h后恢复正常条件培养,同时在培养液内加入不同浓度钾通道阻断剂TEA,继续培养24 h后噻唑蓝(MTT)比色法检测神经元死亡情况.结果 OGD组、OGD+不同浓度TEA组与对照组比较,海马神经元细胞存活率明显降低(P<0.05);OGD+10 μmol·L-1TEA组和OGD+500 μmol·L-1 TEA组与OGD组比较,海马神经元细胞存活率明显升高(P<0.05);而OGD+1 μmol·L-1 TEA组和OGD+5 mmol·L-1 TEA组与OGD组比较,海马神经元细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05).结论 钾通道阻断剂TEA能保护OGD诱导的培养海马神经元免于死亡.提示某些类型的钾通道活动增强可能参与了OGD诱导的培养海马神经元死亡.
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DRAM1对心肌细胞急性缺血损伤的影响
目的：探讨损伤调节自噬基因（DRAM1）对体外大鼠心肌细胞（H9C2）急性缺血损伤的影响。方法：H9C2心肌细胞转染腺病毒后，行氧葡萄糖剥夺（OGD）处理，建立心肌细胞急性缺血模型。采用MTT法检测细胞活性；采用Annex V／PI双染检测细胞凋亡情况。应用Western blotting 检测自噬相关蛋白P62的表达。结果：MTT结果显示，过表达DRAM1明显改善OGD引起H9C2心肌细胞损伤。 Annex V／PI双染结果显示，与对照组相比，过表达DRAM1明显降低OGD引起的H9C2心肌细胞凋亡率；过表达DRAM1明显逆转缺血引起的P62增加。结论：DRAM1对H9C2心肌细胞急性缺血损伤具有保护作用，可能与改善自噬流有关。
