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过表达Ubc9酶对乳大鼠心肌细胞低氧损伤的保护作用
目的 探讨类泛素样修饰蛋白(SUMO)修饰中的泛素缀合酶类E2I(Ubc9)对体外乳大鼠心肌细胞(NRCM)急性低氧损伤的作用及其可能的机制.方法 采用分离纯化细胞法培养NRCM,对NRCM分别转染5,10,20,50和100感染指数(moi)的纯化的大鼠Ubc9基因腺病毒(Adv-Ubc9),转染48 h后在荧光显微镜下分别观察其绿色荧光蛋白(GFP)的荧光强度,并用Western印迹法检测转染效率.NRCM行氧葡萄糖剥夺(OGD)分别处理0,2,4,6,12和24 h后,Western印迹法检测Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、自噬相关蛋白P62/SQSTM1(P62)和微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达.NRCM转染Adv-Ubc950 moi 48 h,使得Ubc9过表达,随后OGD处理6 h,建立心肌细胞急性低氧模型,利用原位末端转移酶标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡,Western印迹法检测Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、P62、LC3和类泛素化修饰蛋白1(SUMO-1)的表达水平,蛋白免疫共沉淀法检测Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平.NRCM转染Ubc9的小干扰RNA(Ubc9-siRNA)48 h,使Ubc9沉默,随后行OGD处理6 h,Western印迹法检测活化的胱天蛋白酶3的表达水平.NRCM给予巴伐洛霉素A1(BFA1)50 nmol·L-1作用2 h,Western印迹法检测LC3表达水平.结果Adv-Ubc9在50与100 moi时转染成功且效率一致,与单纯OGD组相比,过表达Ubc9能明显降低OGD引起的心肌细胞凋亡(P<0.01)、降低活化的胱天蛋白酶3的表达(P<0.01),而沉默Ubc9使心肌细胞OGD处理后的活化的胱天蛋白酶3表达上调(P<0.05),说明过表达Ubc9能抵抗OGD引起的心肌细胞凋亡.与正常对照组相比,OGD处理后,自噬底物P62发生堆积(P<0.01),自噬蛋白LC3Ⅱ明显下调(P<0.05),自噬流出现障碍;当过表达Ubc9后能明显逆转OGD引起的自噬底物P62堆积(P<0.05),改善自噬流障碍,但对自噬蛋白LC3Ⅱ影响不明显.在此基础上给予BFA1阻断自噬体与溶酶体融合过程后,与OGD+BFA1组相比,Adv-Ubc9+OGD+BFA1组的LC3Ⅱ表达明显上调(P<0.01),提示Ubc9改善自噬流障碍的作用可能与同时促进自噬激活和自噬降解过程有关;蛋白免疫共沉淀结果显示,与正常对照组相比,OGD处理后SUMO-1蛋白表达水平基本无变化,而过表达Ubc9后,SUMO-1蛋白表达明显上调(P<0.01),OGD处理后,Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平下调(P<0.01),而过表达Ubc9后,Vps34和Beclin1的SUMO化修饰明显上调(P<0.01),说明过表达Ubc9可能通过提高与自噬激活和自噬降解过程均相关的Vps34和Beclin1的SUMO化修饰,从而同时促进自噬激活和自噬降解过程改善OGD后的自噬流障碍,进而抵抗OGD引起的心肌细胞凋亡.结论 高表达Ubc9酶能显著抑制OGD导致的心肌细胞凋亡,该保护作用可能是增强了Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平,从而同时促进自噬激活(形成自噬体)和自噬降解(自噬体与溶酶体融合)过程,进而改善OGD后自噬流障碍.
