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人全长TALL-1在大肠杆菌中的表达
目的在克隆人TALL-1(TNF- and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand 1)全长 cDNA的基础上,用大肠杆菌进行表达并鉴定其生物学活性.方法采用RT-PCR技术,从HL-60细胞中扩增编码人TALL-1的cDNA,克隆于高效原核表达载体pQE-80L中,以IPTG诱导表达,Ni-NTA层析纯化后,进行生物学活性检测.结果 RT-PCR扩增得到了858 bp的DNA片段,测序结果与GenBank中报道的编码TALL-1的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中获得了高效表达,活性检测发现它能抑制U937细胞的生长.结论成功克隆了人TALL-1全长cDNA,并获得了高效表达及纯化,纯化产物具有生物学活性,这为进一步的功能研究及临床应用奠定了基础.
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小鼠MBL-A基因的克隆和序列分析
目的克隆小鼠甘露聚糖结合凝集素-A(MBL-A)基因的全长编码区cDNA.方法利用RT-PCR方法,从Balb/c小鼠的肝细胞中,分离出MBL-A基因cDNA片段,克隆入pUC-T载体,测序并进行分析.结果扩增得到的小鼠MBL-A基因cDNA全长720 bp,编码240个氨基酸残基,包含了完整的富含半胱氨酸区、胶原区、颈区和糖识别域.分析表明,与Genbank中发表的序列具有99.9%的同源性.结论获得小鼠MBL-A基因的克隆,为进一步研究MBL-A分子在体内的生物学功能奠定了一定基础.
关键词： 甘露糖结合凝集素-A cDNA克隆 小鼠 RT-PCR -
重组人BAFF112-285的制备及活性分析
目的制备具有功能活性的重组人TNF家族的B细胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF fa-mily,BAFF)胞外区112～285氨基酸残基段(rhBAFF112-285),为BAFF的深入研究奠定基础.方法提取人HL-60细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人BAFF胞外区112～285氨基酸残基(BAFF112-285)的cDNA,行序列测定后,构建于原核表达载体pQE-80L并转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达rhBAFF112-285,Ni2+-NTA层析纯化,进而经3H-TdR掺入实验检测其免疫学活性.结果RT-PCR扩增得到了 525bp的DNA片段,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF112-285的cDNA序列一致,该胞外区片段在大肠杆菌中获得了高效表达,表达水平达细菌总蛋白的45.7%,经纯化后纯度可达98.4%,活性检测证实其能明显刺激外周血淋巴细胞活化.结论利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF112-285,所获纯化产物具有生物学活性,所获结果为进一步研究创造了条件.
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中国人前列腺特异膜抗原基因的克隆及序列测定
目的克隆人前列腺膜特异抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)的编码区cDNA片段.方法从前列腺癌组织提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增出人PSMA基因编码区序列,将其克隆至pcDNA3.1载体中,并行序列测定.结果序列测定表明,克隆获得的2 253 bp片段与文献报道的人PSMA基因编码区cDNA序列一致.结论本研究为进一步研究PSMA的生物学性能和用于前列腺癌诊断治疗的可能性打下了基础.
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THANK基因的克隆和序列分析
目的 克隆THANK基因全长及胞外区片段并测序。方法采用RT-PCR技术，从人白血病细胞系HL-60细胞总RNA中扩增人THANK cDNA,并定向克隆于pMD-18 T载体，转染大肠杆菌、抽提质粒后，用ABI PRISMTM377XL DNA自动测序仪测序。结果 RT-PCR扩增出一个858 bp的DNA片段，限制性内切酶图谱分析和测序结果显示：该858 bp片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK基因序列一致。结论 本实验成功地克隆了人THANK基因，为进一步表达人THANK基因并研究其功能，开发与临床应用奠定了基础。
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人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达
目的克隆并原核表达α4亚基片段.方法从IL-60细胞系中提取总RNA,以RT-PCR方法分两段扩增人整合素分子α4亚基片段2.0kbcDNA,将两片段连接,并将其中的1.7kb基因片段亚克隆至表达载体PGEX-KG中,IPTG诱导表达.结果RT-PCR扩增并克隆了α4的两段cDNA,序列分析表明:与文献报道的α4 cDNA序列基本一致.两片段成功连接后,将其中的1.7kb亚克隆至表达载体PGEX-KG中,经诱导在大肠杆菌中得到高效表达.结论获得了α4亚基2.0kbcDNA片段,及其中1.7kb的原核表达产物对于研究α4整合素的功能有重要意义.
关键词： 整合素 α4亚基RT-PCR cDNA克隆 -
中国人MBL cDNA的克隆与序列分析
从中国汉族人胎肝组织提取总RNA,以RT-PCR方法获取了编码含信号顺序的全长甘露聚糖结合凝集素(MBL)肽链的cDNA片段,将其与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌TG1,建立了MBL的cDNA克隆.序列分析表明:与文献报道的人MBL cDNA序列比较,差异颇大,但与GenBank中的人MBL mRNA比较,仅2个位置的核苷酸不同;其编码产物是20个残基的信号顺序和228个残基的成熟MBL多肽.
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人体β-防御素hBD-3的cDNA克隆与鉴定
防御素是一类具有广谱抗微生物活性的小分子多肽,具有抗菌、抗病毒及杀伤肿瘤细胞的多功能效应,其效能强大,且至今尚未发现病菌株对它产生耐药性,有关防御素的基础和临床前应用研究已成为生物医学研究领域的热点之一,深受医学界、药学界瞩目,尤其引人注目的是新近发现的β-防御素.已发现3种人体β-防御素,hBD-1是Bensch等[1]于1995年从肾衰患者血透析液中分离获得的;hBD-2是Harder等[2] 于1997年从银屑病患者病损上皮中分离获得的; 2001年,Harder等[3]又从人体鳞癣皮肤中分离获得hBD-3.有关hBD-1 和hBD-2基因的克隆、表达及其调控已有许多研究报道[4],为开发新一类抗菌药物奠定了一定基础.hBD-3的发现为人体防御素的基础和应用研究注入了新的活力,进一步深入研究人体β-防御素hBD-3基因的表达及其调控机制,建立高效表达具有广谱抗菌活性的人体防御素的生物工程新方法、新技术具有极其重要的意义.本研究利用RT-PCR技术,成功克隆了hBD-3的cDNA片段.
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大劣按蚊核糖体蛋白S7cDNA克隆
随着多种非哺乳动物的核糖体蛋白相继克隆成功,通过同源分析查找核糖体蛋白保守氨基酸序列并推测其功能,已成为核糖体蛋白研究的重要手段之一.然而,昆虫核糖体蛋白的研究仅仅集中在黑腹果蝇、烟草天蛾和冈比亚按蚊等少数几种昆虫[1～3].本实验首次克隆成功东南亚疟疾的重要传播媒介--大劣按蚊,核糖体蛋白S7cDNA,是对昆虫核糖体蛋白研究的重要补充.
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一个希特林缺陷病家系SLC25A13基因的新剪接位点变异及异常转录子
目的 探讨1例希特林缺陷病患儿的临床及遗传学特征.方法 整理分析患儿临床资料,提取患儿及其父母外周血DNA标本,采用靶向外显子测序检测致病突变,并通过一代测序进行验证.提取患儿外周血淋巴细胞mRNA,通过逆转录-PCR、cDNA克隆和Sanger测序等技术,分析新突变对SLC25A13转录产物的影响.结果 患儿为SLC25 A13突变c.845_c.848+ 1delG和c.1841+ 3_1841+4delAA复合杂合子,后一突变尚未见文献报道,克隆结果证实该突变造成mRNA异常剪接,形成异常转录子[r.1841_1842ins1841+1_1841+67;1841+3_c.1841+4del].结论 本研究通过传统DNA分析方法结合cDNA克隆技术,发现了新突变c.1841+ 3_1841+ 4delAA及其异常剪接变异体,为患儿希特林缺陷病确诊提供了实验依据,同时扩展了SLC25A13基因突变谱.
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SH2信号蛋白家族新成员--SH2A基因的克隆及其特性分析
目的在8p22区域克隆新基因,并研究其结构和功能.方法利用定位克隆的策略,通过外显子捕获及外显子拼接技术,克隆新基因,同源序列分析,用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及Northern印迹杂交方法研究其在组织中的表达.结果外显子捕获及拼接得到一序列与推测基因AK024799某一段完全一致,该基因为2880 bp的cDNA,有1个1362 bp的开放阅读框架,编码454个氨基酸,且有1个SH2结构域,称这个新基因为SH2A,定位于8p22.RT-PCR及Northern印迹杂交均表明该基因在各种组织均有表达,而且有3个转录本,该基因在肿瘤组织中的表达较强. 结论 SH2A是SH2信号蛋白家族中的新成员,在信号传导中起接头蛋白的作用,而且与肿瘤发生有关.
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一种从人子宫颈粘液新分离的抗菌多肽的分子特性分析
目的对本室从人子宫颈粘液分离纯化的1个抗菌多肽HCP-1进行分子结构特性分析.方法分离HCP-1多肽,测定其氮端氨基酸序列,根据其氮端氨基酸序列密码子设计简并引物,采用3′-RACE-PCR技术扩增HCP-1编码基因,连接到T载体进行测序.用生物软件分析测序结果.结果以简并引物结合RACE-PCR技术成功的克隆出HCP-1全长cDNA,BLAST分析证实其序列与HMG-17分子相同,OMIGA软件分析发现其含有一个α-螺旋结构(疏水结构区)可能是其抗菌功能的基础.结论 HCP-1为HMG-17,是存在于宫颈粘液抗菌的一种抗菌多肽,其中的α-螺旋结构可能是其抗菌的结构基础.
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大鼠β-防御素rBD-1cDNA克隆
为开展β-防御素基因表达调控分子机制及其转基因防治粘膜感染的研究,作者克隆了大鼠β-防御素rBD-1 cDNA.从大鼠肾脏组织提取RNA,采用RT-PCR技术扩增大鼠β-防御素rBD-1cDNA,并重组到pGEM-T Easy载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定,证实所克隆的cDNA片段为大鼠β-防御素rBD-1 cDNA.
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EBV-LMP1 cDNA克隆与真核表达载体的构建及体外表达
目的:从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)cDNA,构建真核表达质粒pIRES-LMP1,并检测其在体外的表达.方法:利用分子生物学技术,提取鼻咽癌总RNA,逆转录PCR获得LMP1cDNA,克隆入pDrive Cloning Vector并测序,利用引物上设计的酶切位点NheI和EcoRI将LMP1插入真核表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转染COS细胞,采用RT-PCR和Western blot检测LMP1的表达.结果:扩增的LMP1cDNA为1301bp,核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,该表达质粒在体外转染COS细胞后可表达LMP1分子.结论:实验所构建的pIRES-LMP1表达质粒能在体外表达LMP1分子.
关键词： 潜伏膜蛋白1(LMP1) cDNA克隆 核酸测序 真核表达载体 质粒pIRES -
人PPARα受体cDNA全长序列的克隆及测序
目的 对人过氧化物酶体增殖物激活受体α(hPPARα)全长cDNA序列进行克隆并测序,为构建含hPPARα基因真核表达载体奠定基础.方法 通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARα全长cDNA序列,胶回收目的条带后与pMD19-T载体连接并转化DH5α感受态菌,用BamH I、Sal I双酶切及基因测序筛选鉴定阳性克隆pMD19-hPPARα-T载体中hPPARα基因的完整性和忠实性.结果 经酶切和DNA测序证实pMD19-hPPARα-T载体中插入的hPPARα基因序列与GeneBank中提交的序列(NM001001928)一致.结论 成功克隆了hPPARα基因,构建了pMD19-hPPARα-T中间载体,为含hPPARα基因真核表达载体的构建奠定了基础.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体α cDNA克隆 T载体 测序 -
人外周血CD8+T细胞Runx3的基因克隆及其原核表达
目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础.方法:MACS分离外周CD8+T细胞;采用RT-PCR方法从人外周血CD8+T细胞获得Runx3基因的cDNA,并连接pMD19-T载体导入大肠埃希菌DH5α,选择阳性克隆,应用M13 F/R通用引物进行双向反应测序,以作序列鉴定.利用PCR技术从克隆载体pMD19-T/Runx3获得人Runx3的全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pQE30/Runx3;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌M15,测序鉴定后经IPTG 30%诱导4 h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白并进行Western blot鉴定.结果:扩增获得的Runx3基因CDS区全长1 248 bp,编码415个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致.成功构建了原核表达载体pQE30/Runx3,并在工程菌M15中获得大量表达.结论:获得了人Runx3基因的克隆,并成功原核表达和制备出人Runx3融合蛋白.
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人PD-L1 cDNA的克隆及其胞外区蛋白在大肠杆菌中的表达
目的: 克隆人PD-L1基因的cDNA并构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体, 在大肠杆菌中进行表达.方法: 以RT-PCR法从活化的人淋巴细胞总RNA中, 扩增并克隆PD-L1的cDNA, 构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体, 在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定.结果: 克隆到PD-L1 cDNA编码区的全长序列, 经DNA测序证明其与已报道的序列一致.同时构建了在羧基端带有His6标签的PD-L1胞外区基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达.免疫印迹分析表明, 在IPTG诱导后表达的PD-L1胞外区蛋白, 相对分子质量(Mr)为25 000, 与理论值的大小相符.该重组蛋白能与抗His6标签的单抗(mAb)特异性反应.结论: 成功地克隆PD-L1基因, 其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达, 为利用PD-L1转基因修饰移植物或以PD-L1重组蛋白抑制移植排斥反应等研究提供了条件.
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人CD38抗原胞外段基因克隆及表达
目的克隆并表达人CD38抗原分子的胞外段基因. 方法采用RT-PCR法, 从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中, 扩增CD38全长cDNA, 并将其插入pGEM-T载体中.重新设计引物,从重组pGEMT载体中,扩增CD38抗原分子的胞外段基因,再亚克隆到表达载体pET28a(+), 转化大肠杆菌BL21, 用IPTG诱导表达. 结果经酶切鉴定及序列分析表明, 克隆的CD38胞外段基因的序列与文献[1,2]的报道完全一致.将该片段亚克隆到表达载体pET28a(+), 经 IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达. 结论获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物, 对进一步制备单克隆抗体、研究CD38分子的功能具有重要的意义.
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分泌型重组TRAIL基因真核表达载体的构建及其凋亡效应
目的研究新型凋亡因子-TRAIL基因在肿瘤基因治疗中的作用.方法用RT-PCR法,从Balb/e小鼠脾脏的总RNA中扩增出编码凋亡诱导功能区的TRAIL cDNA片段,并克隆入pUC-T载体中.经DNA测序鉴定正确后,亚克隆入真核表达载体pSEC-hy-gromycin的免疫球蛋白κ链信号肽编码区的下游,形成含有κ链信号肽与TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,构建可分泌表达TRAIL的重组真核表达载体pSEC/TRAIL.该重组载体经阳离子脂质体转染入小鼠前胃癌细胞株MFC615中,以台盼蓝拒染法和Hoechst3258荧光染色法,观察重组TRAIL对肿瘤细胞的凋亡效应.结果TRAIL的cDNA克隆成功,构建了可高效分泌表达可溶性TRAIL的重组真核表达载体pSEC/TRAIL,该产物能显著促进MFC615肿瘤细胞凋亡.结论重组真核表达载体pSEC/TRAIL的成功构建,为研究肿瘤的基因治疗提供了理想的工具.
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人整合素分子α 4亚基片段的克隆和表达
目的克隆并表达人整合素分子α 4亚基 1.2 kb cDNA片段。方法从 HL-60细胞系中提取总 RNA，以 RT-PCR法扩增人整合素分子α 4亚基片段 1.2 kb cDNA(1 753～ 2 934 bp)，并将该片段亚克隆至表达载体 pGEX-3X，用 IPTG诱导表达。结果克隆了α 4亚基 1.2 kb cDNA片段。序列分析表明，其所编码的氨基酸序列与文献相比较只有一处错义突变 (Arg→ Gln)，经分析该突变对抗原性影响不大。将该片段亚克隆至表达载体 pGEX-3X，经 IPTG诱导在大肠杆菌中获得高效表达。结论获得了α 4亚基 1.2 kb cDNA片段及其原核表达产物，对研究α 4整合素的功能具有重要的意义。
