人全长TALL-1在大肠杆菌中的表达
摘要： 目的在克隆人TALL-1(TNF- and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand 1)全长 cDNA的基础上,用大肠杆菌进行表达并鉴定其生物学活性.方法采用RT-PCR技术,从HL-60细胞中扩增编码人TALL-1的cDNA,克隆于高效原核表达载体pQE-80L中,以IPTG诱导表达,Ni-NTA层析纯化后,进行生物学活性检测.结果 RT-PCR扩增得到了858 bp的DNA片段,测序结果与GenBank中报道的编码TALL-1的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中获得了高效表达,活性检测发现它能抑制U937细胞的生长.结论成功克隆了人TALL-1全长cDNA,并获得了高效表达及纯化,纯化产物具有生物学活性,这为进一步的功能研究及临床应用奠定了基础.
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慢性牙周炎患者唾液中miR-146a的表达及临床意义
目的 通过检测慢性牙周炎患者唾液中miR-146a的表达,以探讨miR-146a在慢性牙周炎发病中的作用及意义.方法 选取2012年1月至2013年8月期间第三军医大学西南医院口腔科收治的48例慢性牙周炎患者(其中男性28例,女性20例,平均年龄42岁).同时选择20名性别、年龄匹配的健康志愿者作为对照组.采用实时荧光定量PCR技术检测上述人员唾液上清中miR-146a的表达水平.对治疗组患者(32例)进行牙周基础治疗,分别记录治疗前和治疗6周后患者的探诊深度(probing depth,PD)、临床附着丧失(attachment loss,AL)及菌斑指数(plaque index,PLI),并检测治疗后唾液上清液标本中miR-146a的表达.结果 慢性牙周炎患者唾液上清液中miR-146a的表达水平(2.52±0.87)显著高于健康对照组(0.81±0.58)(P＜0.01).治疗组患者经过治疗后的牙周临床指数、唾液中miR-146a表达水平均显著降低(P＜0.05).唾液中miR-146a水平与PD(r=0.574,P＜0.05)、AL(r =0.629,P＜0.01)及PLI(r=0.758,P＜0.01)均呈正相关.结论 慢性牙周炎患者唾液上清中miR-146a表达水平明显高于正常人,并在牙周基础治疗后显著下降,提示唾液miR-146可作为牙周病防治及疗效评估的潜在靶分子.
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MRI辅助下膝关节骨关节炎伴内翻畸形患者股骨远端3种旋转轴线与外科经股骨上髁轴的准确性比较
目的 在磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)上测量膝关节重度骨关节炎(osteoarthritis)伴内翻畸形患者股骨远端不同旋转轴线,评估各参照轴线相对于外科经股骨上髁轴(surgical transepicondylar axis,STEA)的准确性.方法 回顾性分析2013年6月至2014年1月在我中心明确诊断为膝关节重度骨关节炎伴内翻畸形患者(内翻≤15°)86例(86膝)的临床资料,其中男性34例,女性52例;年龄51 ～70(63.7±8.7)岁,由2位医师在MRI横断面图像上定位STEA、临床经股骨上髁轴(clinical transepicondylar axis,CTEA)、后踝轴(posterior condylar line,PCL)外旋3°线(3°extorsion against PCL,3°PCL)、前后轴(anterior posterior line,APL)的垂线,测量各轴线相对于STEA偏差的角度,并用方差分析比较各角度接近STEA的精确性.结果 3°PCL相对于STEA外旋(0.63°±1.82°)、CTEA相对于STEA外旋(3.78°±0.75°),APL垂线相对于STEA外旋(5.38°±3.17°),精确度:A角(3° PCL相对于STEA旋转的角度)＞CSA(CTEA相对于STEA旋转的角度)＞ASA(APL垂线相对于STEA旋转的角度),各角度两两比较差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 膝关节重度骨关节炎伴轻度内翻人群中,股骨远端截骨轴线除STEA外,3°PCL准确性高;术中STEA定位困难时,参照3°PCL进行截骨可获得较好的股骨旋转准确度.
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自体微粒皮移植术修复深度烧伤创面的临床分析
目的 总结自体微粒皮移植术修复深度烧伤创面的临床救治经验.方法 收集2002年11月至2013年8月入我院采用自体微粒皮移植术治疗深度烧伤的214例患者的临床资料,分析治疗过程中各因素对患者预后、创面愈合情况以及近、远期愈合质量的影响.结果 ①伤后1周内与1周后行切痂微粒皮移植的病死率为分别为16.1％、32.1％ (P ＜0.05).②对377个部位的创面愈合率进行分析,B组(扩展比5∶1～10∶1)愈合率高,达(77.23 ±19.91)％,比A组(扩展比小于5∶1)具有明显优势(P＜0.05);在相同愈合率下,B组愈合速度为(1.84 ±0.76)％/d明显快于C组(扩展比大于10∶1)的(1.53 ±0.51)％/d(P＜0.05).③分析创面近期愈后质量显示,174个部位的表皮少量反复破溃,占所有307个部位中的56.68％.④189个部位的创面远期愈后质量显示,其瘢痕增生程度与创面一期愈合率关系密切(X2=11.697,P＜0.05).结论 对深度烧伤患者早期行切痂微粒皮移植能明显降低患者的病死率;适当的扩展比(5∶1～10∶1)具有良好的创面愈合效果;提高创面一期愈后率能有效改善患者的远期愈合质量.
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腺苷酸激活蛋白激酶磷酸化障碍导致烧伤后骨骼肌脂质沉积的实验研究
目的 探讨影响腺苷酸激活蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)/乙酰辅酶a羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)信号通路导致烧伤后骨骼肌脂质沉积(intramyocellular lipids,IMCLs)的分子机制.方法 采用30％体表面积Ⅲ度烧伤小鼠模型,将54只BALB/c小鼠按随机数字表法分为正常对照组、AMPK激活剂(acadesine,AICAR)组、烧伤组、烧伤+AICAR组,同位素标记法检测各组小鼠腓肠肌中肉碱脂酰转移酶-1(carnitine palmitoyl transferase-1,CPT1)活性变化,Western blot检测各组小鼠腓肠肌中AMPK-α、p-AMPK-α、ACC及p-ACC表达水平,通过油红O染色和甘油三酯(triglyceride,TG)测定法评估各组小鼠腓肠肌IMCLs情况.结果 烧伤后小鼠腓肠肌中ACC表达量较伤前显著升高(P＜0.05),而AMPK-α、p-AMPK-α、p-ACC以及CPT1活性均显著降低(P＜0.05).在AICAR作用下,正常小鼠腓肠肌中p-AMPK-α表达显著升高[(1.16±0.08)vs(2.38±0.22),P＜0.05],p-ACC表达显著升高[(1.74±0.10) vs (3.72 ±0.18),P＜0.05],CPT1活性显著升高[(2.95±0.39) nmol/(min·mg) vs (6.35 ±0.68)nmol/(min·mg),P＜0.05],TG含量显著降低[(3.88±0.40) mmol/gvs (2.89 ±0.54) mmol/g,P＜0.05].烧伤+AICAR组小鼠腓肠肌中p-AMPK-α、p-ACC、CPT1活性及甘油三酯含量较烧伤组无显著差异(P＞0.05).正常对照组和AICAR组正常小鼠腓肠肌组织切片油红O染色未见明显脂质沉积,而烧伤组和烧伤+ AICAR组烧伤小鼠腓肠肌组织切片油红O染色均显示有大量脂质沉积,两组间并无显著差异(P＞0.05).结论 骨骼肌中AMPK磷酸化障碍是烧伤后IMCLs的重要分子机制之一.
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地塞米松增强L02细胞P-糖蛋白的表达作用机制的初步研究
目的 探讨地塞米松对人正常肝细胞株L02细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的影响,以及磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途径在调控P-gp表达中的作用.方法 采用Western blot检测体外培养L02细胞P-gp与Akt的表达水平,比较经地塞米松、PI3K/Akt酶抑制剂LY294002及两者联合处理24 h前后L02细胞P-gp表达水平的变化及地塞米松处理24 h前后L02细胞Akt表达水平的差异,分析L02细胞P-gp表达与PI3K/Akt表达之间的关系.结果 10 μmol/L地塞米松刺激24 h后L02细胞P-gp及Akt表达水平较刺激前分别显著增加60.8％ (P =0.026 7)和25.0％ (P =0.035 8);L02细胞中P-gp表达水平与Akt表达水平之间呈显著正相关(Pearson系数=0.87,P＜0.01);LY294002(20 μmol/L)处理组L02细胞P-gp表达水平较对照组(未处理组)显著降低33.8％ (P =0.018 4);地塞米松单独处理组和地塞米松与LY294002联合处理组L02细胞P-gp表达水平分别是对照组的(163.5±18.4)％和(130.1±22.0)％,两者间相差显著(P =0.031 3).结论 地塞米松可能通过激活PI3 K/Akt途径诱导L02细胞P-gp增强表达.
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端粒酶逆转录酶和Gli1、Gli2在胃癌中的表达及意义
目的 探讨端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和Gli1、Gli2在胃癌组织中的表达及意义.方法 利用免疫组化S-P两步法检测72例胃癌及其癌旁组织中hTERT、Gli1、Gli2的表达情况,并结合患者的临床病理资料进行分析.结果 hTERT、Gli1、Gli2在胃癌中的表达明显高于癌旁组织中的表达(P＜0.05),hTERT与Gli1、hTERT与Gli2的表达均呈正相关(r分别为0.502 2、0.624 6,P＜0.05).hTERT、Gli1、Gli2的表达均与淋巴结转移有关(P＜0.05).hTERT、Gli1均高表达组以及hTERT、Gli2均高表达组生存时间较短,三者均高表达组生存时间短(P ＜0.05).结论 hTERT与Gli1、Gli2在胃癌中均高表达,三者联合检测对预测胃癌转移、预后有一定指导意义.
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IL-12A、IL-1B、IL-17A单核苷酸多态性与慢性乙型肝炎恩替卡韦治疗HBeAg血清学转换的遗传关联研究
目的 通过遗传关联研究观察慢性HBV感染免疫相关重要细胞因子IL-12、IL-1B、IL-17的基因多态性与恩替卡韦抗病毒治疗HBeAg血清学转换之间的关联.方法 对109例恩替卡韦抗病毒治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者每3个月进行肝功能、乙肝标志物、HBV DNA检测,进行HBeAg血清学转换评估,治疗24个月时的应答情况作为判定应答与否的标准.发生HBeAg血清学转换者为应答组;未发生HBeAg血清学转换者为无应答组;分析IL-12A rs568408、IL-1 B rs1143623、IL-17Ars8193036基因型与HBeAg血清学转换之间的关联.结果 29例获得HBeAg血清学转换(应答组),80例未获得HBeAg血清学转换(无应答组),总体应答率26.6％.IL-12A rs568408与HBeAg血清学转换显著相关,GA基因型发生HBeAg血清转换的易感性显著高于GG基因型[OR =3.72(1.34～10.32),P=0.012].未发现IL-1B rs1143623[OR=1.99 (0.72 ～5.44),P=0.17]和IL-17Ars8193036 [OR=1.54 (0.32 ～7.33),P=0.60]与HBeAg血清学转换存在关联.结论 IL-12Ars568408与慢性乙型肝炎恩替卡韦治疗HBeAg血清学转换存在关联.
关键词： 乙型肝炎 慢性 恩替卡韦 单核苷酸多态性 HBeAg血清学转换 -
阿司匹林联合氯吡格雷对缺血性轻度颈动脉狭窄患者脑卒中二级预防的作用
目的 对比阿司匹林联合氯吡格雷与单用阿司匹林或氯吡格雷对症状性轻度颈动脉狭窄患者脑卒中二级预防的疗效及安全性.方法 纳入本科2009年1月至2013年8月诊断为症状性轻度颈动脉狭窄的患者,所有患者行全脑血管造影术(DSA)检查确诊狭窄率≤50％,给所有患者服用他汀类药物,联合服用抗血小板聚集药物阿司匹林和氯吡格雷的患者归为双联抗血小板药物组(双抗组),单用阿司匹林或氯吡格雷的患者归为单联抗血小板药物组(单抗组).搜集入院时改良Rankin评分(mRS评分)、美国国立卫生研究院卒中神经功能残损量评分(NIHSS评分)及电话随访患者出院后1年内mRS评分情况、卒中复发及不良血管事件发生情况.结果 共搜集151例症状性轻度颈动脉狭窄患者,其中单抗组及双抗组分别为52、99例,排除10例失访患者,终分别纳入48、93例患者进入分析.通过比较发现单抗组与双抗组同侧卒中复发率(分别为8.3％、2.1％)、非同侧卒中复发率(分别是2.1％、1.1％)、病死率(分别为4.1％、2.1％)无明显差异(P＞0.05),出血发生率(分别为0％、11.8％)有统计学差异(P＜0.05);同侧卒中复发组与卒中未复发组颈动脉狭窄率分别为(46.70±5.16)％、(34.70±9.31)％,斑块面积分别为(86.15±17.15)％、(44.88 ±52.59)％,两组间比较均有统计学差异(P＜0.05),而两组在大颈动脉内膜中层厚度(IMT)值、不稳定斑块上无明显差异(P＞0.05).结论 对颈动脉狭窄≤50％的症状性轻度颈动脉狭窄患者单用阿司匹林或氯吡格雷进行脑卒中二级预防可能更安全.
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NEDD4调控AMPK活性参与心肌细胞慢性缺氧适应的研究
目的 探讨NEDD4在心肌细胞慢性缺氧适应过程中的作用及其可能的机制.方法 ①收集手术矫正的先心病患儿32例,其中紫绀型先心病18例,非紫绀型先心病14例.取术中切除的右室流出道心肌组织作为标本,用免疫组化染色检测NEDD4在心肌细胞中表达的分布,Western blot检测NEDD4在心肌组织中的表达情况;②将H9c2心肌细胞分为常氧组、慢性缺氧组和阳性对照组,其中慢性缺氧组又分为对照组、空白转染组和干扰转染组,设计合成以心肌细胞NEDD4基因为靶标的siRNA,通过阳离子脂质体将合成的siRNA转染至H9c2心肌细胞中,常氧培养(74％ N2,5％ CO2,21％O2)48 h后开始对慢性缺氧组心肌细胞进行缺氧刺激(94％ N2,5％ CO2,1％ O2),缺氧刺激72 h后Western blot检测NEDD4、p-AMPK表达水平变化,流式细胞术检测缺氧刺激所致心肌细胞损伤情况.结果 ①紫绀组患儿术前血氧饱和度明显低于非紫绀组(P＜0.05);免疫组化染色结果显示NEDD4主要分布于心肌细胞质中;与非紫绀组相比,紫绀组患儿心肌组织中NEDD4表达水平显著下降[NEDD4/β3-actin条带灰度比值:非紫绀组(0.72±0.07);紫绀组(0.42±0.06),P＜0.05];②与常氧组相比,对照组心肌细胞死亡比例显著增加(P＜0.05);但干扰NEDD4表达后,缺氧所致心肌细胞损伤比例降低(P＜0.05).Western blot检测结果显示,与空白转染组相比,干扰转染组AMPK磷酸化水平显著增加[p-AMPK/AMPK条带灰度比值:空白转染组(0.21±0.01),干扰转染组(0.88±0.04),P＜0.05].结论 NEDD4可能通过调控AMPK活性参与慢性缺氧情况下心肌细胞代谢的适应调节.
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Shox2基因转染后犬骨髓间充质干细胞HCN4表达的变化
目的 探讨矮小同源盒基因亚型2(short stature homobox 2,Shox2)外源基因对犬骨髓间充质干细胞(canine mesenchymal stem cells,cMSCs)体外诱导分化的影响.方法 分离培养犬骨髓间充质干细胞,用包装好的两种慢病毒载体pLentis-mShox2-RFP及pLentis-RFP分别转染第3代cMSCs,收集转染阳性的cMSCs与乳鼠心肌细胞(rat ventricular myocytes,NRVMs)共培养.实验分4组:A组(RFP-cMSCs组)、B组(RFP-cMSCs+ NRVMs共培养组)、C组(Shox2-RFP-cMSCs组)、D组(Shox2-RFP-cMSCs+NRVMs共培养组).共培养诱导分化5d后,利用嘌呤霉素对cMSCs进行纯化,运用全细胞膜片钳检测诱导出内向电流的动力学特征,运用实时荧光定量PCR、Western blot检测HCN4、Tbx3、Cx45/43、Nkx2.5等标志性基因mRNA和蛋白的表达情况,并行免疫荧光检测.结果 Western blot及RT-PCR检测结果显示,D组细胞Shox2、HCN4、Tbx3、Cx45窦房结细胞特异性基因的表达较A、B、C组明显增高(P＜0.05),B组细胞Cx43及Nkx2.5较C、D组细胞明显增高(P＜0.05);免疫荧光结果显示,在Shox2基因调控作用下,cMSCs有HCN4通道生成;膜片钳检测结果显示,C、D组细胞产生了具有明显时间-电压依赖性的内向电流,且对细胞外Cs+敏感,符合起搏离子流Ⅰf的动力学特征;而A、B组未检测出此电流.结论 经mShox2基因修饰的cMSCs通过体外诱导,产生了起搏离子流Ⅰf并高表达窦房结标志性基因,成功向具有一定自主搏动能力的窦房结样细胞分化.
