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基于颜色判定的RT-LAMP技术检测HCoV-NL63冠状病毒基因
建立了一种适合于国境口岸简便、快速、灵敏和特异检测人冠状病毒NL63 (HCoV-NL63)的核酸检测方法.通过建立基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术,针对HCoV-NL63核衣壳蛋白(Nucleoeapsid,N)基因序列设计出6条特异性引物,在等温条件下(63℃)进行扩增反应60min,在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,并结合浊度仪进行实时监测,以终反应颜色变化作为结果判断标准.利用该方法对同种属其他人冠状病毒、诺如病毒、流感病毒进行检测,以分析该方法的诊断特异性.应用该方法对梯度稀释的HCoV-NL63病毒RNA进行检测,以分析该方法的诊断灵敏性,并与常规real-time RT-PCR方法进行比较.结果显示,本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法在短时间内(40min)即可达到对HCoV-NL63的快速检测.该检测方法与加入其它病毒RNA模板溶液颜色均不产生改变,具有较高的检测特异性.检测灵敏性低检测下限为1 600拷贝/反应.本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-NL63冠状病毒现场快速检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力.
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猪轮状病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用
为了建立一种适用于猪轮状病毒(PoRV)的逆转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)的快速、灵敏检测方法.依据GenBank上登录的PoRV VP7基因保守序列,设计了6条特异性引物,通过对外引物与内引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度和反应条件等进行优化.结果显示,当外引物与内引物浓度比为200 nmol/L∶2 400 nmol/L(1∶12)、Bst DNA聚合酶浓度为0.64 U/μL、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、dNTP浓度为1.0 mmol/L,在恒温(60℃)条件下作用60 min,扩增效果出现明显“梯状”条带,同时对建立的RT-LAMP检测方法进行特异性和敏感性验证,其只有PoRV获得特异性扩增条带,与其他猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒等无交叉反应,具有良好的特异性,低检测分子拷贝数为1.0×102拷贝/μL,具有极高的敏感性.反应结束后肉眼可见阳性扩增产物出现白色沉淀,加入SYBR Green Ⅰ观察颜色变化可以判定结果.该方法适用于野外、基层部门和海关快速检测PoRV的新方法,在临床上有良好的推广意义.
关键词： 猪轮状病毒(PoRV) RT-LAMP 建立 应用 -
荧光RT-PCR与RT-LAMP检测GⅡ4型诺如病毒的比较和应用
目的 建立在临床或疾控上可进行简单、快速、灵敏、有效的GⅡ4型诺如病毒的检测方法.方法 根据GⅡ4型诺如病毒基因组保守序列建立实时荧光RT-PCR和RT-LAMP检测方法,研究两者的敏感性、特异性和灵敏度,并进行临床应用.结果 建立了GⅡ4型诺如病毒的实时荧光RT-PCR和RT-LAMP检测方法,敏感性和特异性良好,灵敏度相当.结论 实时荧光RT-PCR和RT-LAMP可在临床或疾控应用.
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基于微流控等温扩增技术的甲型H1N1流感病毒快速检测
目的:以甲型H1N1流感病毒检测为例,建立一种简便、快速的流感病毒检测方法,为呼吸道传染病疫情防控提供技术支持.方法:整合环介导等温扩增技术(LAMP)和微流控芯片技术,建立微流控实时荧光逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法;针对甲型H1N1流感病毒的M基因序列中8个不同区段设计LAMP引物,根据扩增效果筛选出1套(6条)引物,并进行临床样本检测验证.结果:所建立的检测方法可实现扩增结果的荧光实时判读,能在恒定温度(65℃)30 min内完成扩增反应,检测限可达10 copies/μL,仅对甲型H1N1流感病毒产生扩增曲线,对甲型H3、H5、H7、H9及乙型流感病毒均无扩增;对70份临床样本的检测结果与荧光定量PCR方法一致,特异性和灵敏度均为100％;该方法具有体系封闭、污染小、试剂用量小的优势.结论:所建立的微流控实时荧光RT-LAMP是一种快速、灵敏、特异、简便的检测甲型H1N1流感病毒的方法,便于开展现场检测.
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诺如病毒检测技术研究
诺如病毒是非细菌性腹泻暴发的主要病原之一,对相关检测技术的研究十分必要.本文通过引物、探针、染料的选择,结合适用范围、灵敏度、特异性、重复性的评估对常规反转录-聚合酶链反应、荧光定量RT-PCR、反转录-环介导等温扩增、基因芯片、酶联免疫吸附测定和荧光微球检测条快速检测诺如病毒的技术进行了综述.着重关注了食品和水中诺如病毒检测的病毒富集技术,并提出平衡准确灵敏与简便高效对诺如病毒检测技术的研究具有重要意义.
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猪繁殖与呼吸综合征LAMP检测方法建立
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF6基因为靶基因,设计2对引物,建立PRRSV RT-LAM P检测方法.该检测方法的灵敏度与荧光RT-PCR检测方法相近,高于普通RT-PCR检测方法,约2 h即可得出结果,不需要昂贵的仪器设备,适于猪场PR R SV的监测.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-LAMP -
鲤春病毒核酸检测方法研究进展
对鲤春病毒核酸检测方法的基本原理和应用情况进行了论述,主要包括RT-PCR、荧光定量RT-PCR、环介导等温扩增技术等,并总结了各方法的特点和发展前景。
