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HPLC同时测定赤芝中4种三萜酸的含量
目的:建立HPLC同时测定赤芝药材中灵芝酸C_2、灵芝烯酸A、灵芝酸A和灵芝酸D含量的方法.方法:采用Kromasil C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈-0.03%磷酸水溶液采用梯度洗脱,流速1.0 mL·min~(-1),检测波长252 nm,柱温35℃.结果:灵芝酸C_2、灵芝烯酸A、灵芝酸A和灵芝酸D的线性范围分别为:5.0～50.0 mg·L~(-1)(r=0.999 9),7.2～72 mg·L~(-1)(r=0.999 9).11.67～116.7 mg·L~(-1)(r=0.999 9)和5.32～53.2 mg·L~(-1)(r=0.999 8);平均回收率(n=3)分别为98.8%(RSD1.5%),99.1%(RSD1.9%),99.5%(RSD1.4%)和98.5%(RSD1.9%).结论:该方法简便、准确,重复性好,为赤芝药材的质量控制提供了实验依据.
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灵芝酸A对乳腺癌MCF-7细胞迁移和对激酶插入区受体基因表达的影响
目的 研究灵芝酸A对乳腺癌MCF-7细胞迁移及激酶插入区受体(KDR)基因表达的影响.方法 将对数生长期乳腺癌MCF-7细胞分为空白组、对照组和低、高2个剂量实验组.空白组用改良杜氏伊格尔培养基100 μL处置;对照组用0.25 mg·L-1的表柔比星溶液100 μL处置;低、高2个剂量实验组用0.1,0.5 mmol·L-1的灵芝酸A溶液100 μL处置.用噻唑蓝比色法检测各组乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率,用细胞划痕实验检测乳腺癌MCF-7细胞迁移能力,用逆转录-聚合酶链反应检测各组乳腺癌MCF-7细胞KDRmRNA表达水平,用免疫印迹法检测各组乳腺癌MCF-7细胞KDR蛋白表达水平.结果 处置24h后,空白组、低剂量实验组、高剂量实验组和对照组的MCF-7细胞增殖抑制率分别是(0.00)％,(39.57±5.29)％,(71.37 +7.35)％和(72.03±7.64)％;这4组的细胞愈合率分别是(73.27±8.66)％,(52.48±6.54)％,(18.73±2.31)％和(18.35±2.48)％;这4组的KDR mRNA相对表达量分别是0.95±0.12,0.65±0.07,0.21±0.02和0.20±0.01;这4组的KDR蛋白相对表达量分别是1.05±0.13,0.81±0.10,0.43±0.05和0.41±0.05,3个给药组与空白组比较或高剂量实验组和对照组与低剂量实验组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 灵芝酸A能剂量依赖性地抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖,有效降低细胞迁移能力,其作用可能与下调KDRmRNA及KDR蛋白表达有关.
关键词： 灵芝酸A 乳腺癌MCF-7细胞 细胞迁移 激酶插入区受体基因 -
HPLC法测定灵芝子实体和孢子粉中灵芝酸C2、灵芝酸G和灵芝酸A
目的 建立灵芝子实体和孢子粉中3种灵芝酸类成分的HPLC测定方法,为全面评价灵芝药材和孢子粉的质量提供依据.方法 采用HPLC方法测定,Diamonsil(钻石)C8色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相乙腈-0.03％磷酸(28∶72),体积流量1.2 mL/min,检测波长250 nm;柱温35℃.结果 灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸A分别在0.40～10.06 μg(r=0.999 99)、0.40～10.00 μg (r=0.999 99)、0.40～10.00 μg(r=0.999 99)线性关系良好,平均回收率分别为101.04％、99.39％、101.22％,RSD值分别为1.64％、1.86％、2.20％(n=6):灵芝子实体中3种灵芝酸的质量分数分别在0.06～0.29 mg/g、0.12～0.37 mg/g、0.19～0.41 mg/g,灵芝孢子粉供试品中3种灵芝酸的质量分数分别在0～0.01 mg/g、0、0～0.03 mg/g.结论 本方法简便,稳定,可用于灵芝三萜类成分C2、灵芝酸G、灵芝酸A的定量分析.
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多指标评价微乳提取灵芝有效组分的实验研究
目的 探索以微乳为溶剂同时提取灵芝中灵芝三萜和多糖的可行性.方法 以灵芝酸A、灵芝三萜、灵芝多糖及固形物含有量为指标,比较微乳回流、微乳温浸、微乳超声、乙醇回流及水煎煮对于灵芝中灵芝三萜和灵芝多糖的提取效率.结果 用微乳作为溶剂提取灵芝,可同时提取灵芝中的脂溶性三萜组分及水溶性多糖组分,且微乳温浸法及微乳超声法较佳.微乳超声提取液中三萜的含有量相当于乙醇回流液的96.43％,多糖的含有量相当于水煎煮液的77.63％；微乳温浸提取液中三萜的含有量相当于乙醇回流液的80.96％,多糖的含有量相当于水煎煮液的85.36％.结论 微乳可同时提取灵芝中脂溶性和水溶性组分.
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灵芝破壁孢子粉中总三萜酸含量测定
灵芝孢子为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.exFr.) Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang的子实体发育后期弹射释放出的种子,是灵芝的生殖细胞.孢子内含有脂肪油、三萜酸类、多糖等;孢壁含有纤维索2.36～3.52％,几丁质52.08％～57.64％[1],矿物元素硅9.2mg/g和钙713μg/g等,使得孢壁坚硬有韧性[2],结构复杂且耐酸、碱,孢子内含物的有效成分在体内难以释放,影响临床疗效[3],故采用现代工艺技术进行破壁,称破壁孢子粉.近代药理研究证明灵芝破壁孢子粉有抗肿瘤、增强免疫、降血糖、降血脂、镇静、清除自由基、抗辐射、促进新陈代谢、延缓衰老[4-6]等作用,而灵芝三萜类化合物涵盖了绝大部分孢子粉的药理活性.因此,对破壁孢子粉中三萜酸含量进行测定有利于控制其质量.文献报道的总三萜酸测定方法有5％的香草醛-冰醋酸溶液、高氯酸溶液显色法[7-10]、硫酸无水乙醇检测法[11]等.但上述方法都忽略了脂肪油对三萜酸含量测定的干扰,从而影响了测定结果的准确性.本文采用萃取法对灵芝破壁孢子粉三萜酸提取液进行除油预处理,既消除脂肪油对三萜酸测定的干扰,义避免显色过程的不平行性对结果的影响,使测定结果更准确的反映破壁孢子粉中总三萜酸的含量.
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反相高效液相色谱法测定灵芝子实体中灵芝酸A的含量
目的 建立测定灵芝子实体中灵芝酸A含量的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定方法.方法 采用Promosil-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-体积分数0.03％甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速为0.8 ml/min,检测波长254 nm.结果 灵芝酸A的质量浓度在1.1～11μg范围内与峰面积呈良好线性关系,r=0.999,Y=1.121X-0.112,RSD=1.61％(n=6).结论 RP HPLC测定方法简便、快速、准确、重复性好,可用于控制灵芝子实体的质量.
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一测多评法定量分析灵芝及灵芝孢子粉中单体三萜成分的应用
目的:建立灵芝及灵芝孢子粉中灵芝酸A、灵芝酸C2的一测多评含量测定方法.方法:采用高效液相色谱(HPLC)法,以灵芝酸A为内标物,建立其与灵芝酸C2的相对校正因子,并进行含量测定,实现一测多评.采用外标法测定10批灵芝及灵芝孢子粉中灵芝酸C2含量验证一测多评法的准确性.结果:采用外标法、一测多评法测得灵芝酸C2含量的平均相对误差为1.07％,含量计算值与实测值无统计学差异(P＞0.05).结论:建立的校正因子在不同实验条件下重现性良好,在对照品缺乏的情况下,以灵芝酸A为内参物建立灵芝孢子粉中2种指标成分含量测定的一测多评法可行.
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灵芝酸A对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响
目的：探讨灵芝酸A对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法体外培养人骨肉瘤HOS和mg-63细胞与0.1、0.25和0.5 mmol/L的灵芝酸A孵育，采用CCK8检测HOS和MG-63细胞的增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，Transwell检测细胞的迁移和侵袭。Western blot检测细胞中p-STAT3、STAT3、p-p38、p38和NF-ΚB1蛋白的表达变化。结果灵芝酸A能够显著抑制人类骨肉瘤HOS和MG-63细胞的增殖，促进细胞凋亡以及抑制细胞迁移，并且这种效应存在剂量依赖性。与0.5 mmol/L灵芝酸A孵育能够显著降低HOS和MG-63细胞中STAT3的磷酸化水平，增加p38磷酸化水平，同时增加NF-κB1的表达水平。结论灵芝酸A能够杀死人类骨肉瘤HOS和MG-63细胞，可以作为抗骨肉瘤的药物进行开发。
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HP LC-ELSD法测定灵芝中灵芝酸A的含量
目的 建立测定灵芝药材中灵芝酸A质量分数的HPLC-ELSD法.方法 采用Welch XtimateTM-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-体积分数0.01%醋酸(体积比37:63),流速为1 mL/min,柱温为30℃,进样量为10μL;蒸发光散射器漂移管温度为105℃,空气流速为2.8 L/min.结果 灵芝酸A的进样量在0.8928~5.3568μg范围内,峰面积的对数值与进样量的对数值具有良好的线性关系;平均加样回收率为95.81%;不同批次的灵芝样品中灵芝酸A的质量分数范围为0.2143~2.8942 mg/g,结果差异较大.结论 本法操作简单、结果准确、重复性好,为灵芝的质量控制提供参考方法.
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灵芝酸A对人前列腺癌细胞DU-145细胞凋亡的影响
目的 初步探讨灵芝酸A对人前列腺癌细胞DU-145细胞凋亡的影响.方法 培养DU-145细胞,然后使用0、0.1、0.25以及0.5 mmol/L灵芝酸A进行诱导,处理DU-145细胞24 h后收集细胞然后提取总RNA;处理DU-145细胞48 h后收集细胞提取总蛋白;采用荧光定量PCR和Western blot检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3和LivinαmRNA水平和蛋白水平的表达变化.结果 采用灵芝酸A处理人前列腺癌细胞DU-145细胞能够显著上调Bax和Caspase-3 mRNA水平和蛋白水平的表达量(P<0.01),显著下调Bcl-2以及LivinαmRNA水平和蛋白水平的表达量(P<0.01),促进前列腺癌细胞DU-145细胞凋亡,并且随灵芝酸A剂量的升高细胞凋亡增加.结论 灵芝酸A能够促进DU-145细胞凋亡,可能是通过调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3和Livinα的表达发挥作用.
关键词： 灵芝酸A 前列腺癌细胞DU-145 细胞凋亡 凋亡相关基因 -
高效液相色谱法测定荣保灵芝1号中灵芝酸A的含量
目的 建立荣保灵芝1号子实体及其孢子粉中灵芝酸A的含量测定方法.方法 采用高效液相色谱法,UltimateTM XB-C 18色谱柱,柱温:25℃,流速:0.800 mL/min,检测波长:254 nm,流动相为乙腈(B)-0.1％冰乙酸水溶液(A),梯度洗脱.结果 灵芝酸A的线性范围是0.010～1.200 mg/mL (r=0.9998),平均回收率为100.55％,相对标准偏差为1.70％(n=6),子实体中灵芝酸A的含量范围在2.221 7～3.531 1 mg/g,孢子粉中灵芝酸A的含量范围在0.167 2～0.742 9 mg/g.结论 该方法简便,专属性和重复性好,对连续3年采集的荣保灵芝1号子实体和孢子粉中的灵芝酸A进行测定,其含量都随年份的增加而增加.
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不同溶媒提取对灵芝中灵芝酸A的药动学影响
目的 考察不同溶媒提取对灵芝中灵芝酸A药动学的影响.方法 给大鼠灌胃灵芝水提取物和60％乙醇提取物,测定大鼠血浆中灵芝酸A的浓度,计算相应的药动学参数.结果 60％乙醇溶液提取物的灵芝酸A药动学参数T1/2alpha、T1/2beta、AUC和T1/2Ka在各剂量组均高于水溶液提取组(P＜0.05).结论 不同溶媒提取对灵芝提取物中灵芝酸A在大鼠体内的药动学有显著影响.
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RP-HPLC和UV-VIS法测定灵芝不同收获期的多糖肽和灵芝酸
目的 研究灵芝不同栽培方式和不同收获期中多糖肽和灵芝酸A、B的变化,为灵芝规范化栽培及制定产品质量标准提供依据.方法 RP-HPLC测定菌草灵芝和仿野生栽培的灵芝提取物的灵芝酸A、B的变化.色谱柱为XB-C18柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相为0.05％磷酸-乙腈(65∶35),检测波长254 nm,常温,进样量50μL.以灵芝多糖肽为对照品,采用Folin-酚试剂法,通过紫外-可见吸收光谱法检测菌草灵芝和仿野生栽培灵芝不同收获期提取物的多糖肽.结果 灵芝酸A、B线性范围分别为14.8～371.0和16.4～409.0 μg/mL,平均回收率为95.0％、100.5％,RSD分别为1.18％、3.37％(n=6).灵芝多糖肽在100～600 μg/mL与吸光度值呈线性关系,r=0.999 5,回收率95％～100％.结论 该方法简便、快速,可用于灵芝及其产品中多糖肽和灵芝酸A、B的质量控制.菌草灵芝沸水提取能将多糖肽和灵芝酸分离,既简化了灵芝水、醇提取工艺,又提高经济效益.
