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马兜铃内酰胺I对肾小管上皮细胞的损伤作用
目的:了解马兜铃内酰胺I(AL-I)是否导致肾小管上皮细胞损伤.方法:以体外细胞培养的人类近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为研究对象,以马兜铃酸I(AA-I)为阳性对照,采用LDH释放试验检测AL-I的直接细胞损伤作用;用相差显微镜、电子显微镜观察细胞形态变化,用流式细胞仪分析细胞DNA含量以及细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)表达水平,以了解细胞凋亡情况;采用ELISA法检测细胞培养上清液中细胞外基质成分纤连蛋白(FN)以及促纤维化细胞因子转化生长因子β1(TGF β1)的分泌水平.结果:AL-I(2.5～20 mg·L-1)具有浓度依赖的直接细胞损伤作用;细胞形态、DNA含量及PS表达水平分析表明,AL-I在上述浓度范围内能够导致HK-2细胞凋亡,并能够导致HK-2细胞分泌TGF β1及FN.与AA-I的作用进行比较发现:在相同浓度情况下,AL-I的直接细胞毒作用强于AA-I,但其导致细胞凋亡、TGF β1及FN分泌的能力弱于AA-I.结论:马兜铃酸的代谢产物AL-I能够造成肾小管上皮细胞的损伤,作用与AA-I相似.尽管其致损伤作用较AA-I弱,但仍有可能是含马兜铃酸中药导致肾脏损伤及其纤维化过程的毒性成分之一.
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代谢酶在马兜铃酸肾病中的作用
马兜铃酸(aristolochic acid,AA)是马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy,AAN)的致病因素,已受到国际上的高度重视,有关AA肾毒性机制的研究目前已成为毒理学领域的研究热点之一.马兜铃酸Ⅰ(AAI)是马兜铃酸的主要毒性成分,氧化和还原是AAI体内快速清除必不可少的代谢过程.参与AAI氧化还原的代谢酶及此代谢过程在AAN中的作用取得了重大进展,因此对相关的研究结果进行综述,为进一步深入研究AAI肾毒性机制提供参考.
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HPLC法测定养阴降压胶囊中马兜铃酸I、氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷
目的：建立HPLC波长切换法同时测定养阴降压胶囊中马兜铃酸I、氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷。方法采用HPLC法，Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：[甲醇–乙腈（2∶1）]-0.02%磷酸溶液，梯度洗脱；0～16 min在390 nm波长下检测马兜铃酸Ⅰ，16～40 min时在230 nm波长下检测氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷；体积流量1.0 mL/min；柱温35℃；进样量10μL。结果马兜铃酸I、氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷质量浓度分别在4.72～94.40（r＝0.9998）、3.95～79.00（r＝0.9999）、6.39～127.80（r＝0.9999）、19.81～396.20μg/mL（r＝0.9991）与峰面积呈良好的线性关系；平均回收率分别为97.47%、99.09%、100.09%、98.88%，RSD值分别为1.19%、1.60%、0.84%、0.65%。结论所建立的方法简便，重复性好，为有效控制养阴降压胶囊的质量提供了依据。
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马兜铃酸I诱导人肾小管上皮细胞转分化的作用及机制
目的：探讨马兜铃酸I(Aristolochic acid I，AAI)在人类肾小管上皮细胞(HKC)转分化中的可能作用，了解AAI引起肾小管间质损害的机制。方法：将体外培养HKC细胞分为无血清对照组(C组)和AAI实验组两组，在AAI组培养液中加入不同剂量AAI；两组HKC细胞分别培养48h后，应用间接免疫荧光法检测HKC细胞角蛋白、波形蛋白和α-1平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达的变化；应用流式细胞技术检测表达α-SMA阳性(+)的HKC细胞百分率；采用免疫酶标技术(ELISA)检测HKC细胞上清液中转化生长因子β1(TGF β1)的表达。结果：间接免疫荧光法观察，可见不同剂量AAI处理后的HKC细胞表达角蛋白减弱，表达α-SMA及波形蛋白增强；应用流式细胞术检测，发现不同剂量AAI(10，20，40，80 μg／L)处理后，表达α-SMA(+)的HKC细胞百分率与AAI剂量呈正相关(r=0.0867，P＜0.005)；当AAI为20，40，80μg／L时，HKC细胞表达α-SMA百分率为8.6％，9.6％，13.4％，较C组(平均值为3.1％)明显增高(P＜0.05)。应用ELISA法观测AAI对HKC细胞分泌TGF β1的影响，可见C组HKC细胞有基础水平的TGFβ1分泌(21.7％ng／L)；当予一定剂量的AAI(10，20μg/L)刺激HKC细胞24h后，细胞上清液中TGFβ1水平明显升高(75.6 ng／L，65.6 ng／L vs 21.7 ng／L，P＜0.05)；当AAI浓度分别为40，80μg／L时，HKC细胞分泌TGFβ1水平则明显降低。结论：①一定浓度的AAI可诱导体外HKC细胞部分转分化；②一定浓度的AAI可刺激HKC细胞分泌TGF β1；高浓度AAI抑制HKC细胞分泌TGF β1；③AAI诱导HKC细胞转分化可能部分与TGF β1分泌增多有关，但其确切机制尚待进一步研究。
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马兜铃酸I对肾小管上皮细胞超微结构的影响
目的:观察马兜铃酸I(Aristolochic Acid I)对肾小管上皮细胞超微结构的影响,并与庆大霉素所致损伤进行比较研究. 方法:以体外培养的人近端肾小管上皮HKC细胞作为研究对象,分别给予马兜铃酸I(200、800、3 200 μg/L)和庆大霉素(200、800、3 200 mg/L),并设对照组,24 h后检测细胞数量、细胞生存率、培养上清乳酸脱氢酶(LDH)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)含量.细胞经处理后,采用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化,单盲下随机计数20个细胞,统计各组细胞超微结构差异. 结果:24 h后,在各组细胞数、细胞生存率、培养上清LDH和NAG酶等指标都尚无显著变化时,给药组细胞超微结构已经发生显著变化.马兜铃酸I组细胞以核结构变异为主,表现为核畸形、核仁缺失、巨核、小核、核膜增生卷曲等;高浓度组细胞同时具有少量线粒体肿胀等膜性结构变化.马兜铃酸I组中细胞核变异及膜性结构变异程度都与剂量成显著正相关.庆大霉素组细胞以溶酶体变化为主,产生髓样小体、残余小体等,并可见发育不良的线粒体等,变异程度与剂量成正相关.庆大霉素组核变异状况与正常对照组无显著差异,与药物剂量也无显著相关性. 结论:马兜铃酸I对人肾小管上皮细胞超微结构的影响以核变异为主,在高浓度偶见线粒体肿胀等膜性结构改变.庆大霉素作用后细胞主要表现为产生大量髓样小体、残余小体、发育不良的线粒体等,细胞核变异不显著.两种药物对肾小管上皮细胞超微结构的影响存在明显差异.
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HPLC法测定广防己中马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I的含量
目的 建立广防己药材中马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I的含量测定方法.方法 HPLC法测定广防己药材中马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I的含量.采用Aglient C18柱(Extend),以甲醇为流动相A,1%醋酸-0.02%三乙胺水溶液为流动相B,采用梯度洗脱;流速0.8 mL/min;检测波长316 mm.结果 在各自的考察范围内,马兜铃酸和马兜铃内酰胺I的线性关系均良好(r值均大于0.99),平均回收率分别为98.55%和97.20%,RSD分别为1.62%(n:6)和1.93%(n=6).结论 本方法简便、准确、回收率高,可用于广防己药材中马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I的含量测定.
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三七总皂甙对马兜铃酸Ⅰ诱导人肾小管上皮细胞转分化的作用及机制
目的 探讨三七总皂甙(PNS)治疗肾间质纤维化的作用机制.方法 将人肾小管上皮细胞(HK-2)按不同处理因素分为6组,空白对照组不予干预;PNS对照组加入PNS,使终质量浓度为 400 μg/ml;马兜铃酸I(AA I)诱导组加入AA I,终质量浓度为20 μg/ml;PNS低、中、高剂量组均加入AA I 20 μg/ml,同时分别加PNS 200、400、600 μg/ml.培养48 h后应用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;免疫组织化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;ELISA法测定细胞上清液中TGF-β1水平;RT-PCR法检测结缔组织生长因子(CTGF) mRNA表达.结果 AA I诱导组HK-2细胞从原来典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态,胞质内大量表达α-SMA,其积分光密度值、TGF-β1水平、CTGF mRNA表达均增加(P＜0.05);PNS各剂量组细胞形态学改变减轻,α-SMA、CTGF mRNA表达和TGF-β1分泌降低,且呈剂量依赖性(P＜0.05);PNS对照组各指标均无明显变化.结论 PNS可抑制AA I诱导的肾小管上皮细胞转分化作用,其机制可能是抑制TGF-β1及其下游因子CTGF表达.
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马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I对大鼠肾小管损伤机制及其对肾脏水通道蛋白1表达的影响
目的 研究马兜铃酸I(AA-I)和马兜铃内酰胺I(AL-I)在亚急性毒性条件下对大鼠肾小管损伤的毒性机制及其对肾脏水通道蛋白1(AQP1)表达的影响。方法 AA-I及AL-I以高、中、低剂量(9.0，4.5，2.25 mg/kg)连续腹腔注射给药7d，在给药第5天后，收集24h尿液，对各组总尿量进行比较，并用ELISA方法检测尿液中β2-微球蛋白（β2-MG）含量。给药7d后，取全血检测血生化，并用HE法染色观察肾脏病理组织学变化；用ELISA和免疫组织化学方法分析AA-I及AL-I在高、中、低剂量时肾脏组织AQP1的表达变化。结果 AA-I及AL-I在给药第5天即出现β2-MG排泄量增加，血生化中血浆离子浓度出现异常。AA-I及AL-I在9.0、4.5、2.25 mg/kg的剂量下均能明显抑制AQP1的表达，且存在一定的剂量依赖关系。结论 AA-I及AL-I 均能导致肾脏毒性，且AL-I的肾毒性作用强于AA-I。AA-I及AL-I在肾小管损伤早期均可抑制AQP1表达，这与其早期导致大鼠尿量增加的利尿作用有关。
