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黄芪散对高糖作用下成骨细胞相关功能的影响
目的:观察黄芪散含药血清对高糖条件下成骨细胞功能的影响及与糖尿病性骨质疏松发病机制相关基因的影响,探讨黄芪散(HQS)对糖尿病性骨质疏松症的疗效机制.方法:选用健康清洁级5周龄Wistar大鼠10只,随机分为正常组和药物组.制备黄芪散含药血清和空白血清,选用健康清洁级新生大鼠乳鼠4只,体外以酶消化法分离培养新生乳鼠颅骨成骨细胞(0b),行细胞计数(CCK-8)法测定高糖条件下(25.5 mmol·L-1)5％,10％,20％,30％含药血清对细胞增殖的影响,选取增殖活性佳血清浓度,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测黄芪散对成骨功能相关基因骨桥蛋白(OPN),骨钙素(OC),碱性磷酸酶(ALP)和胰腺-骨骼相关基因骨保护素(OPG),叉头转录因子1(FoxO1)表达的影响.结果:10％和30％血清浓度组细胞增殖较空白组有明显升高(P＜0.05);20％血清浓度组较空白组有显著升高(P＜0.01).与空白组比较,5％浓度条件下,OPN,OPG mRNA表达明显下调(P＜0.05);10％浓度条件下,OC,ALP,OPNmRNA表达明显上调(P＜0.05,P＜0.01);OPG,FoxO1 mRNA较空白组表达显著下调(P＜0.01).20％浓度和10％浓度条件差异性一致,OPN,OPG,FoxO1 mRNA影响趋势较10％浓度药物血清组更明显.20％浓度血清条件下,与空白组比较,OC和OPN蛋白表达显著上调(p＜0.01),OPG蛋白表达显著下调(P＜0.01).结论:黄芪散对糖尿病性骨质疏松的疗效机制可能与其促进高糖作用下成骨细胞增殖作用有关,与下调胰腺-骨骼相关基因OPG,FoxO1表达有关.
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叉头转录因子1质粒标准品的构建
背景:研究表明叉头转录因子1是一种新的2型糖尿病易感基因,但2型糖尿病患者与健康人的叉头转录因子1基因在转录水平上差异性的研究不多.由于还没有商品化叉头转录因子1的质粒标准品,因此有必要构建其标准品.目的:构建应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测叉头转录因子1 mRNA的质粒标准品.设计、时间及地点:单一样本重复实验,于2007-1 1/2008-03在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成.材料:SYBR ExScriptTM反转录-聚合酶链反应Kit试剂盒,SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒,凝胶回收纯化DNA试剂盒,质粒DNA小量纯化试剂盒,PMDl8-T Vector试刺盒等.方法:从健康志愿者血标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板应用聚合酶链反应扩增出目的片段,对其回收纯化连接到PMD18-T载体及转化JMl09,阳性克隆经测序分析,确认重组质粒正确.抽提重组质粒,用紫外分光光度仪测定其浓度,再根据公式换算成拷贝浓度,后稀释成梯度标准品.主要观察指标:重组质粒聚合酶链反应和基因测序结果,标准品标准曲线的相关系数及标准品的重复性.结果:成功构建了叉头转录因子1质粒标准品,通过聚合酶链反应及基因测序鉴定其目的片段已成功插入载体.各稀释度的标准品经荧光定量-聚合酶链反应扩增后,其循环阈值与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性范围是2.39×(105-1012)copies/mL.各稀释度标准品的批内重复性好,其变异系数范围为0.29%～1.16%.结论:实验成功构建了具有较好灵敏度和重复性的叉头转录因子1质粒标准品.
关键词： 质粒标准品 叉头转录因子1 荧光定量-聚合酶链反应 -
SIRT1激动剂对大鼠急性心肌梗死后心脏功能、心肌细胞凋亡的影响及机制
目的 观察沉默信息调节因子1(SIRT1)激动剂对大鼠急性心肌梗死(AMI)后心肌细胞凋亡的影响,探讨可能的机制.方法 将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、溶媒组和激动剂组,每组10只;后三组大鼠建立AMI模型后,激动剂组、溶媒组分别腹腔注射SIRT1激动剂SRT172020 mg/(kg·d)及等量的DMSO,假手术组、模型组均腹腔注射等量生理盐水,连续7d.于末次给药后次日,检测各组心脏功能[左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)];处死各组大鼠后,检查梗死区组织形态学变化,TUNEL法检测心肌梗死组织中细胞凋亡情况,Western blotting法检测心肌梗死组织中的SIRT1、叉头转录因子1(FoxO1)、Bax、Bcl-2蛋白及FoxO1乙酰化水平.结果 与假手术组比较,模型组和溶媒组大鼠LVEDD、LVESD均升高,LVEF、FS均降低,心肌细胞凋亡指数均升高,心肌梗死组织中SIRT1、FoxO1、Bcl-2蛋白相对表达量均降低,而Bax蛋白相对表达量和FoxO1乙酰化水平均升高(P均<0.05).与模型组和溶媒组比较,激动剂组大鼠LVEDD、LVESD均降低,LVEF、FS均升高,心肌细胞凋亡指数降低,心肌梗死组织中SIRT1、FoxO1、Bcl-2蛋白相对表达量均升高,而Bax蛋白相对表达量、FoxO1乙酰化水平均降低(P均<0.05).结论SIRT1激动剂可改善AMI大鼠心脏功能,减少心肌细胞凋亡;其机制可能与促进SIRT1表达,下调FoxO1乙酰化水平有关.
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白藜芦醇对糖尿病白内障大鼠正沉默信息调节因子2相关酶1基因表达的影响
目的 探讨白藜芦醇对糖尿病白内障大鼠晶状体正沉默信息调节因子2相关酶1(SIR T1)基因表达的影响.方法 80只Wistar大鼠随机分为4组:正常对照组、糖尿病模型组及白藜芦醇低剂量组及白藜芦醇高剂量组.糖尿病模型组、白藜芦醇低剂量组及白藜芦醇高剂量组一次性腹腔注射链脲菌素(STZ)(60 mg/kg)制备糖尿病大鼠模型.成模后低剂量组每日20 mg/kg,高剂量组每日100 mg/kg予白藜芦醇灌胃.裂隙灯显微镜照相机记录各组晶状体变化.12周实验结束时测定各组大鼠晶状体丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶含量.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组大鼠晶状体SIRT1、肿瘤抑制因子P53、叉头转录因子1、核转录因子κB(NF-κB)表达情况.结果 糖尿病模型组大鼠晶状体均发生不同程度混浊,甚至完全混浊,形成白内障.白内障糖尿病大鼠晶状体MDA(7.96±0.51)nmol/mg· prot较正常对照组(4.21±0.27)nmol/mg·prot升高(P＜0.01),糖尿病白内障大鼠晶状体SOD、谷胱甘肽过氧化酶[(31.92±5.03)和(7.43±1.53)u/mg· prot]较正常对照组[(61.86±6.17)和(13.61±2.27)u/mg·prot]降低(P＜0.01).高剂量白藜芦醇组大鼠晶状体MDA(4.64±0.42)nmol/mg· prot较白内障糖尿病大鼠晶状体(7.96±0.51) nmol/mg·prot降低(P＜0.01).高剂量白藜芦醇组大鼠晶状体SOD、谷胱甘肽过氧化酶[(52.41±6.54)和(12.76±1.72)u/mg·prot]较白内障糖尿病大鼠晶状体SOD、谷胱甘肽过氧化酶[(31.92±5.03)和(7.43±1.53)u/mg· prot]增高(P＜0.01).白内障糖尿病大鼠晶状体SIRT1 mRNA表达(0.187±0.034)较正常对照组大鼠(0.523±0.089)降低(P＜0.01).高剂量白藜芦醇组大鼠晶状体SIR T1 mRNA表达(0.497±0.072)较白内障糖尿病大鼠晶状体(0.187±0.034)增强(P＜0 01).白内障糖尿病大鼠晶状体tP53、叉头转录因子1、NF-κB mRNA表达(0.816±0.153)、(1.269±0.231)、(0.896±0.029)较正常对照组(0.592±0.104)、(0.674±0.112)、(0.495±0.008)增强(P＜0.01).高剂量白藜芦醇组糖尿病大鼠晶状体P53、叉头转录因子1、NF-κ B mRNA表达(0.609±0.107)、(0.713±0.121)、(0.397±0.018)较白内障糖尿病大鼠(0.816±0.153)、(1.269±0.231)、(0.896±0.029)降低(P＜0.01).结论 白藜芦醇可能通过调节SIRT1表达,进一步调节下游基因P53、又头转录因子1、NF-κB的表达,抑制和延缓晶状体上皮细胞凋亡,延缓糖尿病大鼠白内障的发生发展.
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内脏脂肪素对糖尿病小鼠肝组织AKT、FoxO1及PEPCK表达的影响
目的 观察内脏脂肪素(visfatin)对糖尿病小鼠肝脏蛋白激酶B(AKT)、叉头转录因子1(FoxO1)及磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)表达的影响,探讨visfatin在肝组织糖异生过程中的作用.方法 16只C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组及饮食诱导高脂组,24只KKAy小鼠随机分为糖尿病模型组、visfatin组及visfatin+ LY294002组,分别予PBS、PBS、PBS、visfatin(6μg/kg,0.05mL/10g)、visfatin(6μg/kg,0.05 mL/10g)+LY294002(0.35 μg/g,0.05 mL/10g)干预3d后,测定血糖、血脂及胰岛素,计算HOMA-IR,RT-PCR测定肝组织AKT、FoxO1、PEPCK的mRNA表达,免疫组化测定肝脏组织AKT、FoxO1蛋白表达.结果 糖尿病模型组AKT mRNA及蛋白表达较正常对照组及高脂组均显著降低(P＜0.01),FoxO1mRNA及其蛋白、PEPCK mRNA表达较正常对照组均显著增高(P ＜0.01);visfatin组AKT mRNA及蛋白表达较糖尿病模型组显著增高(P＜0.05),FoxO1 mRNA及其蛋白、PEPCK mRNA表达较糖尿病模型组均显著降低(P＜0.01);visfatin+ LY294002组AKT mRNA及蛋白表达较visfatin组显著降低(P＜0.01),FoxO1蛋白表达较visfatin组显著增高(P＜0.05).结论 Visfatin可能通过PI3 K/AKT途径调节FoxO1的表达,参与到肝组织糖异生过程中.
关键词： 内脏脂肪素 蛋白激酶B 叉头转录因子1 磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶
