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基于微流控芯片的动态胚胎培养
目的:在微流控芯片上模拟输卵管收缩和纤毛运动引起的流体机械刺激和生化刺激,发展一种接近生理状态的胚胎动态培养方法,探讨其在体外受精-胚胎培养中的价值.方法:按功能构建微流控芯片,优化流体速度,使小鼠受精卵在芯片微孔中接受持续的灌注培养,同时在芯片上实现胚胎发育的监测.比较用微流控芯片法和常规微滴培养法的胚胎发育情况和囊胚形成率.结果:微流控培养系统流体速度在10 μl/h时胚胎发育情况较好,获得的囊胚率高(47.9％,23/48).体外受精胚胎在微流控培养组5～8细胞发育率、桑葚胚发育率和囊胚形成率均明显高于微滴培养组(53.1％ /46.6％、50.3％ /41.5％和45.5％ /35.5％),两组之间比较差异均有统计学意义(P均＜o.05).而两种培养方法获得的2～4细胞发育率分别为63.4％和60.2％,差异无统计学意义.结论:胚胎培养过程中的物理微环境会影响胚胎质量,这种基于微流控芯片的胚胎动态培养方法可以显著改善胚胎质量,有希望成为辅助生殖技术中胚胎培养的一种新型工具.
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自制空气动态培养采样架在手术室的应用
根据手术室感控要求,需定期进行动态细菌培养以确保手术室的洁净程度,即检测手术室回风口空气质量. 目前医院内有两种层流回风口,一种距离地面13 cm,高57. 5 cm,长78 cm;另一种距离地面10 cm,高37 cm,长120 cm. 空气动态培养需在回风口附近放置培养皿,使其与地面呈30°. 目前,由于缺乏专门放置培养皿的装置,大多手术室会就地取材,用几个不同高度的凳子,在其上搁置斜板用来放置培养皿,这样不仅操作繁琐,而且容易出现滑落,难以满足医院管理的要求. 针对这个问题,我科自行设计了空气动态培养采样架,并在临床使用中取得了良好效果,现介绍如下.
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一种组合式组织工程动态培养仪
随着组织工程技术应用的多样化,为不同的目标组织提供不同的培养条件,改进工程组织的化学和生物力学性能,或通过不同的培养条件诱导干细胞向不同方向分化,这些得到了学者们越来越多的关注.结合中国现有的实验室条件,中国医学科学院,北京协和医学院 整形外科医院自主研发了一种组合式组织工程动态培养仪,以为不同的目标工程组织提供不同的动态培养环境.
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一种可提供循环可控的动态力学刺激的组织工程动态培养仪
为工程组织提供力学刺激,以提高培养效果的组织工程动态培养越来越受到关注.研究表明,周期性变化的力学刺激相比持续恒定的力学刺激更能模拟人体生理环境,因而更有利于工程组织的生长和分化.但现有的组织工程动态培养仪或生物反应器多采用恒定的力学刺激为工程组织提供培养环境.为了利用周期性变化的力学刺激改善培养效果,笔者研发了此组织工程动态培养仪.该培养仪通过单片机控制系统实现其核心功能,提供可以调节的周期性的力学刺激.
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自体软骨细胞复合Ⅰ型胶原支架体外动态培养的实验研究
[目的]比较体外静态与动态培养两种方式对培养人关节软骨细胞复合Ⅰ型胶原支架材料的效果,从而探索体外构建移植物用于治疗关节软骨缺损的适宜条件及方式.[方法]分离培养人关节软骨细胞,P2代软骨细胞接种于Ⅰ型胶原支架,随机分为3组,A组:静态培养;B组:动态培养;C组:单层培养.采用倒置相差显微镜、荧光显微镜、SEM、HE染色观察细胞在支架上的分布、黏附、生长及形态特点,实时荧光定量PCR检测软骨细胞表型特异基因Ⅱ型胶原的表达情况.[结果]体外单层培养的软骨细胞(P2)以多角形为主,Ⅱ型胶原蛋白表达阳性,提示P2代细胞表型维持良好;与A组比较,B组细胞数量较多且分布均匀,细胞形态较均一,以多角形为主;A、B组样本大体结构及内部孔隙结构均保持完整,孔隙内均可见细胞黏附,B组孔隙内细胞数量及细胞外基质优于A组;A、B组的Ⅱ型胶原基因mRNA表达水平较单层培养组明显增加.[结论]软骨细胞复合Ⅰ型胶原支架体外动态培养较静态培养可明显促进细胞增殖及细胞外基质分泌.因此,动态培养有望成为体外构建自体软骨细胞移植术所需移植物的一种有效方法.
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动态培养对骨髓间充质干细胞在三维多孔支架中成骨分化的影响
目的 研究动态培养条件下人骨髓来源的间充质干细胞在三维多孔支架中的成骨状况.方法 从人骨髓中分离间充质干细胞进行体外培养扩增,将第3代细胞与多孔β-磷酸三钙支架复合.对细胞/支架复合体进行动态灌注培养(动态培养组)以及静态培养(静态培养组),28 d后采用MTT法检测三维支架中细胞的增殖.通过p-磷酸硝基苯法检测碱性磷酸酶活性,以及应用ELISA方法检测培养过程中骨桥蛋白及骨钙素的分泌.同时对培养后的细胞/支架复合体进行电镜观察及组织学检测,观察人骨髓间充质干细胞形成矿化细胞外基质的能力.结果 培养28 d后,动态培养组细胞增殖及ALP活性显著高于静态培养组(P<0.05).整个培养过程中,动态培养组骨桥蛋白及骨钙素的分泌高于静态培养组.静态培养组中细胞仅在多孔支架周缘增殖,而动态培养组中细胞则在整个支架内增殖.另外,动态培养组支架中形成的组织及新生骨明显多于静态培养组(P<0.05).结论 动态培养有利于人骨髓来源的间充质干细胞在三维多孔支架中增殖并向成骨方向分化.
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旋转灌注式生物反应器系统构建及在骨组织工程中的应用
构建一种旋转灌注式生物反应器系统,并设计制造具有相互连通微管道结构的大段支架.生物反应器在旋转的同时实现对大段支架的灌注,系统内外气体的实时交换通过安装在反应器两端的半透膜和可透气的蠕动泵软管实现.容器内的氧气和营养物质在得到充分混合之后,连续不断地输送到支架微管道内,使黏附在微管道内的细胞获得充足营养的同时受到一定流体剪应力的刺激,调节细胞功能的发挥.该系统克服了静态培养中存在的各种缺点,改善了培养环境,增加了培养过程的可控性,有助于促进黏附在微管道内部的细胞增殖、分化和产生大量基质.将成骨细胞/支架结构体在该生物反应器系统中培养14d后,用扫描电镜观察细胞在大段支架微管道内的生长情况,结果表明,支架微管道内有大量细胞长入.
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可控微管道结构支架构造及旋转式动态培养研究
骨组织工程中,支架的构造,尤其是支架内部微管结构的构造,是一项十分关键的技术.利用光固化快速成形间接构造方法,制备尺寸适合,空间走向、分支、相互连通性完全可控的微管道结构支架.光学显微镜下观察表明:所构造微管道尺寸均在200～600 μm,其空间走向、分支与设计结构一致,微管道之间完全相互连通.将所构造支架复合成骨细胞之后,分别置入6孔培养板和自行研制的旋转式三维动态培养系统,进行体外培养.用扫描电镜观察细胞在其表面和内部微管道的生长情况.结果表明:三维动态培养条件下,支架表面的细胞分布更加均匀,微管道内部也有少量细胞长入.
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动态力学因素在组织工程化血管构建中的作用及其研究进展
动态培养环境是成功构建具有生理功能和力学性能的工程化组织的重要因素之一.越来越多的研究证实,接近生物体内生理环境的动态力学条件对细胞在体外支架上的黏附、增殖、分化以及细胞外基质的重建等一系列生长行为均有重要的作用,通过模拟和优化动态培养条件,可以促进细胞的生长和细胞外基质的重建,从而提高组织工程化血管的性能.本文对近年来在组织工程化血管动态培养环境方面的主要研究进展做了综合评述,重点讨论了不同力学环境对血管细胞生长和细胞外基质重建的影响,以及生物反应器在组织工程化血管构建中的作用,并通过组织工程化血管的生物学性能分析,讨论了动态力学培养环境对血管组织的形成及其力学性能的作用.
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利用温敏胶原动态培养构建组织工程复合物的初步研究
目的 研究动态培养条件下以BMSCs为种子细胞、温敏胶原(thermosensitive collagen hydrogel,TCH)为细胞黏附基质和聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA)为支架材料体外构建的细胞-支架复合物形态及功能特征.方法 分离Fischer344大鼠长骨来源的BMSCs,并体外扩增至第3代作为种子细胞,利用PLLA纤维编织材料作为支架,结合TCH为细胞黏附基质构建细胞-支架复合物.实验组和对照组细胞-支架复合物分别行动态培养和静态培养.体外培养7d对两组复合物行大体观察和扫描电镜观察,检测培养0、1、3、7d后复合物中总DNA含量.结果 两种方式培养后胶原均包绕PLLA支架材料并形成致密的膜状结构.扫描电镜观察示,实验组复合物表面BMSCs呈梭形沿长轴排列整齐,细胞活性良好,表面可见绒毛凸起,纵断面见PLLA纤维之间充满胶原纤维和细胞;对照组复合物表面BMSCs呈延展状态,PLLA之间的细胞相对较少.体外培养1、3、7d实验组细胞-支架复合物中总DNA含量均明显高于对照组(P＜0.05).与培养0d比较,两组培养1、3、7d的总DNA含量均逐渐升高,但仅7d时总DNA含量与培养0d比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 利用TCH和PLLA纤维联合构建的复合细胞外基质具有良好的生物相容性,动态培养可促进BMSCs在材料表面和内部的分布,促进细胞增殖,可用于组织工程复合物的体外构建.
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体外模拟压应力三维动态培养构建组织工程软骨的实验研究
目的 通过体外模拟压应力刺激兔软骨细胞复合脱细胞软骨细胞外基质(extracellular matrix,ECM)源性三维多孔支架培养组织工程软骨,探讨生物反应器中三维动态培养对软骨生长的促进效应. 方法 取健康成年新西兰大白兔四肢关节软骨分离培养软骨细胞,将第2代细胞复合于脱细胞软骨ECM源性三维多孔支架,静态预培养5d后随机分为2组,A组继续静态培养,B组于生物反应器中进行动态压应力加载(频率l Hz,15％压缩应变)培养.3周后采用活-死细胞染色试剂盒检测细胞活性,扫描电镜观察细胞在支架上的生长及分布,定量检测支架中细胞的糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)、胶原蛋白及DNA含量,进行力学分析检测弹性模量. 结果 激光共聚焦显微镜观察示,B组支架内细胞生长良好且分布均匀;A组细胞生长较差,中心区域失染.扫描电镜观察示,B组软骨细胞在支架上黏附、增殖、生长良好;A组软骨细胞明显减少,且分布散乱.生化成分分析示,B组胶原蛋白、GAG及DNA含量分别为(675.85±27.93)μg/mg、(621.72±26.75)μg/mg、(16.98±3.23)μg/样本,A组分别为(438.72±6.35)μg/mg、(301.63±30.51)μg/mg、(10.18±4.39)μg/样本,B组各成分含量均明显高于A组(t=18.512,P=0.000;t=17.640,P=0.000; t=2.790,P=0.024).力学性能测试示,B组弹性模量(0.67±0.09)MPa显著高于A组(0.49±0.16)MPa和空白支架(0.43±0.12) MPa,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 生物反应器模拟压应力三维动态培养优于普通静态三维培养,可提供有利于软骨细胞在ECM支架中生长的佳环境,是体外构建组织工程软骨的良好方法.
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一种基于微流控芯片的胚胎动态培养方法
目的:建立一种接近生理状态的胚胎动态培养方法.方法:按功能设计和构建微流控芯片,使小鼠体外受精卵在微流控芯片微孔中接受持续的灌注培养,同时模拟输卵管收缩和纤毛运动引起的流体机械刺激和生化刺激,并与常规微滴培养法比较,监测胚胎发育情况和囊胚形成率.结果:微流控芯片动态培养方法可显著改善胚胎的质量.与常规微滴培养法相比,微流控动态培养获得的4-细胞胚胎、桑椹胚和囊胚形成率均有显著提高(68.4±1.2％ vs 53.2±2.5％; 55.3±2.6％ vs 45.5±3.3％; 40.5±2.7％ vs 35.5±2.3％)(P＜0.05).而2种方法获得的卵裂率无统计学差异(75.5±3.2％ vs 73.9±4.2％,P＞0.05).结论:在微流控芯片上实现了小鼠近生理状态的胚胎培养,显著改善了胚胎质量,有希望成为一种胚胎培养的有力工具.
