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基于颜色判定的RT-LAMP技术检测HCoV-OC43冠状病毒
目的 建立基于颜色判定的适用于国境口岸简便、快速、灵敏和特异的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法检测人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)核酸.方法 通过序列比对,选择HCoV-OC43(GenBank号:KU131570)为参考株,根据其核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白基因保守区序列设计6条特异性引物,在65℃等温条件下扩增45 min.在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,以终反应颜色变化作为结果判断标准.对病毒核酸依次倍比稀释以检验该方法的灵敏性;同时,对甲型、乙型流感病毒和其他HCoV进行检测,以检验该方法的特异性.结果 通过引物筛选终选定了1组特异性引物,仅能与HCoV-OC43病毒核酸产生特异性反应并出现颜色改变,而与其他病毒均不能产生颜色变化,具有较高的特异性.与常规荧光定量RT-PCR法相比,该方法检测灵敏度达5.6拷贝/反应,灵敏度更高,且在短时间内达到对HCoV-OC43基因快速检测的目的.结论 建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-OC43病毒快速、灵敏、特异性检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力.
关键词： 人冠状病毒 逆转录环介导等温扩增 可视化检测 -
人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用比较
分别设计HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异的引物与荧光标记探针,并合成含靶基因的模板RNA,建立常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR方法,对其灵敏性、特异性和可重复性以及用于临床样本的适用性等进行平行比较评价.结果表明:这两种方法皆可对HCoV-NL63或HCoV-HKU1进行特异性诊断,其中荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度均可达10拷贝/25μL反应体积,不同批次重复检测结果间的变异系数均小于5%.上述方法应用于158份临床鼻咽拭子标本,其中荧光定量RT-PCR方法检出6份HCoV-NL63阳性标本,5份HCoV-HKU1阳性标本,而常规RT-PCR方法则分别检出HCoV-NL63阳性与HCoV-HKU1阳性各3份.对常规RT-PCR方法获得的阳性样品进行序列分析证实上述方法的可靠性.本实验成功建立了可用于临床标本检测的人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步证实荧光定量RT-PCR检测方法检出率明显高于常规RT-PCR方法,这为开展HCoV-NL63和HCoV-HKU1的流行监测及临床早期诊断提供了有效技术手段.
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福州地区重症呼吸道感染患儿中4种人冠状病毒的检测与分析
目的 了解4种人冠状病毒(HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E)在福州急性重症下呼吸道感染患儿中的感染状况及临床意义.方法 收集2007年11月至2015年1月因呼吸道感染住进医院儿科重症监护病房的小儿鼻咽抽取物标本,共计266份.通过RT-PCR法先用一对通用引物对人冠状病毒pol基因片段进行检测.测序并BLAST比对分析8份阳性产物.对用HCoV通用引物检测阳性的标本,再分别用两种人新型冠状病毒HCoV-HKU1和HCoV-NL63的特异性引物进行扩增检测.对这8株病毒进行系统进化分析.结果 检出8例HCoV感染阳性病例,检出率3.0％.其中2例感染HCoV-HKU1,1例感染HCoV-NL63,1例感染HCoV-229E,4例感染HCoV-OC43.在这266例住院患儿中HCoV-HKU1感染的检出率约为0.75％;HCoV-NL63和HCoV-229E感染的检出率约为0.38％;HCoV-OC43感染的检出率约为1.50％.检测出两例HCoV-HKU1与人副流感病毒3型(HPIV-3)的混合感染.系统进化分析表明这8株HCoV分成4簇,2株HCoV-HKU1属于HKU1基因型A.结论 4种人冠状病毒可能是儿童下呼吸道感染中较为重要的病原.
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青海地区急性呼吸道感染症候群中人冠状病毒及鼻病毒分子流行病学研究
目的 了解青海地区急性呼吸道感染人群中人冠状病毒(human coronavirus,HCoV)及鼻病毒(human rhinovirus,HRV)的分布,探讨其分子流行病学特征.方法 采集2010年5月至2015年5月青海地区急性呼吸道症候群病例鼻咽拭子445例,采用荧光定量反转录聚合酶链式反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法对HCoV 6种亚型(OC43,HKU1,229E,NL63,SARS和MERS)及HRV进行检测,并分析其分子流行病学特点.结果 445例样本中共检出HCoV 34例,检出率7.64％,其中HCoV-OC43 19例(4.26％)、HCoV-HKU1 15例(3.37％),其他亚型未检出.HRV检出16例,检出率3.59％.HCoV-OC43在20-60岁年龄组检出率高,为9.48％,且不同年龄组差异有统计学意义(Fisher's确切概率P =0.0011).HRV在门急诊病例中的检出率比住院病例高,为6.72％,且差异有统计学意义(Fisher's确切概率P =0.0432).HCoV-OC43与HCoV-HKU1夏季检出率高,分别为为7.20％ (9/125)、9.60％(12/125);不同季节HCoV检出率差异有统计学意义(x2=25.08,P＜0.0001).HRV春季检出率高,为10.17％ (6/59),不同季节检出率差异有统计学意义(Fisher's确切概率P=0.0449).HCoV感染阳性样本Ct值中位数36.81(35.54-37.49),在住院病例中为36.93(35.54-37.53),在门急诊病例中为36.68(31.18-36.84),差异无统计学意义.HRV阳性样本Ct值中位数31.83 (27.16-33.65),在住院病例中为28.97(26.39-33.79),在门急诊病例中为32.34(30.85-33.65),差异无统计学意义.结论 HCoV及HRV流行高峰主要为夏季和春季,其中HCoV-OC43/HCoV-HKU1是HCoV感染的主要亚型.Ct值在一定程度上反映了HCoV和HRV在不同病例类型中病毒载量的差异.
关键词： 急性呼吸道症候群 人冠状病毒 人鼻病毒 荧光定量反转录聚合酶链式反应 流行病学 -
新型人冠状病毒NL63膜蛋白(M)基因的序列分析及其抗原表位预测分析
目的 了解新发现的、与北京地区婴幼儿急性呼吸道感染相关的人冠状病毒HCoV-NL63的主要结构蛋白--膜蛋白(M)的基因特征.方法 分别从2份已确认为HCoV-NL63阳性的、取自急性呼吸道感染患儿的标本(BJ3140和BJ8081)中用RT-PCR方法扩增得到其M蛋白的全基因,在对其进行了序列分析的基础上对推导出的M蛋白的抗原表位进行了预测分析.结果 BJ3140和BJ8081的M蛋白编码基因全长681 bp,编码一个含226个氨基酸的蛋白.BJ3140和BJ8081之间M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%和99.6%;与HCoV-NL63原型株有很高的核苷酸(99.1%～99.7%)和氨基酸同源性(99.6%和98.7%),而与HCoV-229E的氨基酸同源性为61.3%,与HCoV-OC43和SARS-CoV氨基酸同源性则低于31.0%.BJ3140和BJ8081的M蛋白N端21个氨基酸位于病毒包膜外区,随后是3次跨膜区,后是较长的包膜内区.不同方法的预测结果显示BJ3140的M蛋白的B细胞表位优势肽段多位于C-末端包膜内区域.结论 从北京地区婴幼儿HCoV-NL63感染阳性的呼吸道标本中扩增得到的M蛋白编码基因与HCoV-NL63原型株有很高的同源性,具有与其他冠状病毒M蛋白相似的结构特征.
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3种新近发现的呼吸道病毒感染流行病学研究
目的 调查2011年1 ～12月急性呼吸道感染病人的人偏肺病毒、人冠状病毒和人博卡病毒的流行特点.方法 采集2011年1 ～12月笔者医院收治的急性呼吸道感染患者鼻咽拭子标本1158份,采用巢式PCR法检测hMPV、HCoV-NL63、HBoV的核苷酸,分析hMPV、HCoV-NL63、HBoV的流行特点.结果 hMPV的检出率为1.47％,检出率在2月份高,为4.76％,临床诊断全部为上呼吸道感染；hMPV感染在7个月～1岁组的检出率高.HCoV-NL63的检出率为0.78％,检出率在7月份高(2.65％),临床诊断全部为上呼吸道感染；HCov-NL63感染在7个月～1岁组的检出率高.HBoV的检出率为1.55％,检出率在6月份高(8.77％),临床诊断为下呼吸道感染14例,上呼吸道感染4例；HBoV感染在7个月～1岁组的检出率高.结论 人偏肺病毒在秋冬季节发生率较高,人冠状病毒在夏秋季节发生率较高,人博卡病毒在5-6月份发生率较高,3种病毒均在婴幼儿中发生率较高.
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甲型H1N1流感病毒感染患者中人冠状病毒和人偏肺病毒感染情况的初步分析
目的 了解北京地区部分甲型H1N1流感病毒感染确诊急诊患者中人冠状病毒HCoV-OCA3、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和人偏肺病毒(HMPV)的感染情况和临床表现特点.方法 从2009-10～11期间北京地区部分确诊感染甲型H1NI流感病毒病例中,选择采集32份鼻咽拭子标本,利用荧光定量RT-PCR法进行HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和HMPV筛查;对阳性患者进行临床表现初步分析.结果 32份鼻咽拭子标本中荧光定量RT-PCR检出4例(12.5%)HCoV-229E阳性,1例(3.1%)HCoV-HKU1阳性,2例(6.3%)HMPV阳性,未检测到HCoV-OCA3和HCoV-NL63阳性;检出阳性标本的临床表现为急性呼吸道症状,病情较轻,病程多为1周左右.结论 2009-10～11北京地区部分确诊的感染甲型H1N1流感病毒病例中存在有人冠状病毒或人偏肺病毒共感染的情况.
关键词： 甲型H1N1流感 人冠状病毒 人偏肺病毒 荧光定量RT-PCR -
人冠状病毒引起上海地区住院儿童下呼吸道感染的流行病学调查
目的：了解人冠状病毒（HCoV）在上海地区下呼吸道感染住院患儿中的流行情况及临床特点。方法回顾性分析2009年10月至2012年9月因急性下呼吸道感染住院的5岁以下患儿554例，采用 Seeplex RV12 ACE 试剂盒检测鼻咽分泌物标本中的 HCoV 以及其他呼吸道病毒。反转录PCR 进行 HCoV-229E、HCoV-OC43、严重急性呼吸综合征（SARS）-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和 MERS-CoV 检测，采用2种实时定量 PCR 进一步筛查中东呼吸综合征（MERS）-CoV。应用MEGA5．0软件进行序列拼接比对及进化树分析。结果554份标本中，273份病毒检测阳性，占48．56％。HCoV 阳性18份，占3．25％，其中13份为 HCoV-OC43／HKU1阳性，5份为 HCoV-229E／NL63阳性，未检测到高致病性 MERS-CoV 和 SARS-CoV。18例感染 HCoV 患儿月龄为1～48个月，男12例，女6例。临床表现为发热17例，咳嗽11例，气促9例，需要接受氧疗7例，喘息1例。6例来自ICU，12例来自普通内科病房。2例来自普通内科病房患儿同时合并腺病毒和人鼻病毒感染。18例患儿均治愈、好转出院。6例于秋季感染，5例于冬季感染，3例于春季感染，4例于夏季感染。8份 HCoV阳性标本进行测序分析，分属于 HKU1和229E 亚型各3株，分属于 OC43和 NL63亚型各1株。结论上海地区5岁以下急性下呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本中可分离到 HCoV，未检测到高致病性MERS-CoV；感染患儿临床表现较重但预后良好。
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深圳市儿童医院急性呼吸道感染患儿人冠状病毒感染情况分析
目的 了解2009年6月 2010年5月深圳市儿童医院急性呼吸道感染患儿人冠状病毒(human coronavirus,HCoV)-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1感染情况及临床特征.方法 呼吸道感染患儿533例,采集鼻咽拭子标本后应用实时荧光定量PCR方法检测人HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1,分析HCoV感染患儿临床特征、感染情况及季节分布等特点.结果 HCoV感染患儿29例,感染率为5.4％,其中HCoV-OC43感染16例,HCoV-229E感染4例,HCoV-NL63感染6例,HCoV-OC43及HCoV-229E混合感染3例;27例(93.1％)患儿年龄≤3岁;感染率居前4位的月份依次为1月(11.9％)、9月(8.1％)、10月(7.1％)、11月(7.1％);临床表现为发热、咳嗽、气喘,6例合并哮喘急性发作,诊断为支气管肺炎16例、急性支气管炎11例、毛细支气管炎1例、急性上呼吸道感染并轮状病毒肠炎1例.结论 急性呼吸道感染患儿HCoV感染高峰在秋冬季,以HCoV-OC43感染多见,年龄≤3岁儿童易感.
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2012-2015年广州地区人冠状病毒及其亚型流行病学特征
目的 对2012-2015年广州地区发热呼吸道感染患者中人冠状病毒(HCoV)及亚型进行监测,分析其流行特征,为HCoV的预防和监控提供参考依据.方法 收集2012年7月至2015年7月期间广州地区14家哨点医院符合标准的发热呼吸道感染病人的咽拭子标本,采用Real-time PCR方法进行HCoV及亚型检测,对HCoV阳性标本同时检测其它7种呼吸道病毒以了解混合感染情况;检测结果采用SPSS17.0统计分析,Excel作图表,结合病例信息,从人口学特征、年龄、季节、性别等方面对HCoV及亚型的流行特征进行分析.结果 2012-2015年间共收集了5 519份咽拭子标本,其中HCoV阳性病例174份,检出率为3.15％.住院病例检出率明显高于门急诊病例,差异有统计学意义(x2=9.432,P＜0.05);男女之间发病率差异无统计学意义(x2=0.848,P＞0.05);感染发病高峰出现在冬夏两季,各季节发病率差异有统计学意义(x2=29.352,P＜0.05);以41～66岁年龄组检出率高为4.05％,各年龄段发病率差异有统计学意义(x2=5 519.000,P＜0.05).亚型229E、0C43、NL63和HKU1检出分别为32例(0.58％)、92例(1.67％)、30例(0.54％)和19例(0.34％),HKU1和OC43同时感染1例,未检测到SARS和MERS亚型.阳性病例中51例发生混合感染,3例为三重感染,48例为二重感染,以混合流感为主.结论 2012-2015年广州地区HCoV流行高峰在冬夏两季,主要感染50岁以上的中老年人,因此要加强中老年人冬夏季节的防护,预防以HCoV感染导致的住院率和混合感染增高.
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2010-2012年广州地区人冠状病毒及其亚型分布
目的 了解2010-2012年广州地区发热呼吸道感染病人的冠状病毒(HCoV)流行状况和特点,为进一步了解人冠状病毒的流行规律及防控奠定基础.方法 收集广州市2010-2012年5家哨点医院共3 376例符合要求的发热同时伴随有呼吸道感染症状病人的咽拭子标本及相关临床信息,采用Real-time PCR方法检测冠状病毒的核酸并对其进行主要型别鉴定,从人群分布、月份分布及各型别发病率等方面进行分析.结果 3 376例发热伴有呼吸道感染症状的病例中,55例为冠状病毒阳性标本,检出率为1.63％.亚型OC43、229E和NL63阳性的标本分别为23、13和19例,阳性率分别为0.68％、0.39％和0.56％,其中SARS、HUK1及EMC亚型未检出.冠状病毒流行高峰为1月(5.33％),不同月份之间发病率比较差异有统计学意义(x2=38.197,P＜0.01);阳性率高年龄组为60～93岁,检出率为2.6％.亚型OC43发病高峰为12-1月,与其他月份比较差异有统计学意义(x2=30.054,P＜0.01),检出率高的年龄组为60～93岁(1.3％);229E月分布较为分散,各月份间差异无统计学意义(x2=15.651,P＞0.05),在各年龄组的分布呈不集中趋势;NL63流行高峰为6-9月,与其他月份比较差异有统计学意义(x2=5.801,P＜0.05),检出率高的年龄组为7～17岁(1.03％).结论 广州市2010-2012年冠状病毒流行高峰为1月份,老年组检出率高;亚型中OC43阳性率高,NL63次之,229E亚型阳性率低;0C43流行高峰为冬季,老年组检出率较高;229E流行高峰及感染人群较为分散;NL63流行高峰为夏季,儿童青少年组检出率高.
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深圳地区婴幼儿人冠状病毒NL63和HKU1的检测与分析
目的 了解深圳地区急性呼吸道感染婴幼儿人冠状病毒NL63 (HCoV-NL63)和人冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)的感染情况及其感染所致疾病的临床特征和流行规律.方法 收集2010年10月-2011年6月因急性呼吸道感染(ARTI)而就诊于深圳市福田区妇幼保健院的0～6周岁患儿的咽拭子标本共179份,同时采集来院体检的0～6周岁健康婴幼儿的咽拭子86份作为健康对照组标本；根据文献资料合成引物及探针,采用荧光PCR方法分别检测标本中HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异性基因.结果 179份患儿标本共检出共检测到4份HCoV-NI63阳性,阳性率为2.22％ (4/179),1份HCoV- HKU1阳性,阳性率为0.56％ (1/179).健康对照组标本未检测出两种病毒.结论 深圳地区急性呼吸道疾病婴幼儿患者中存在感染HCoV-NL63和HCoV- HKU1的情况.冬春季可能存在一个HCoV-NIM3感染的高发期.
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呼吸道新发现病毒的研究进展
儿童呼吸道感染是当前儿科发病率和住院率高的一种疾病,病毒是儿童呼吸道感染重要的致病原.近来新发现的人偏肺病毒,人冠状病毒NL63.HKU1和SARS-相关冠状病毒、人博卡病毒、人多瘤病毒WUPyV,KIPyV都与小儿呼吸道感染有关.该文就这些新发现的呼吸道病毒的流行病学和临床特征及实验室诊断等方面作一综述.
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社区获得性肺炎患儿中人冠状病毒感染的多中心研究
目的 了解社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)患儿中人冠状病毒(human coronavirus,HCoVs)的感染状况.方法 2014年11月至2016年11月,从6个地区的13家医院采集诊断为CAP的患儿的鼻咽抽吸物(nasopharyngeal aspirations,NPAs)或咽拭子,应用液相芯片技术筛查标本中4种人冠状病毒OC43、HKU1、229E和NL63,分析其流行特征和重症肺炎及并发症.结果 共采集3 047例CAP患儿的NPAs或咽拭子:(1)病毒总检出率为52.94％(1 613/3 047),HCoVs检出率为2.53％ (77/3 047),其中HCoV-OC43的检出率高,为1.38％ (42/3 047);(2) 2015年北方地区春季HCoVs检出率为4.92％ (16/325),夏季为4.27％ (14/328),秋季为1.40％ (5/357),冬季为1.42％(3/211).南方地区春季检出率为3.56％ (19/534),夏季为0.57％ (2/353),秋季为2.50％ (5/200),冬季为1.56％ (2/128);(3) 0～1岁、1～3岁、3～6岁和≥6岁年龄组的HCoVs检出率分别为3.48％(30/861),2.53％ (24/950),2.58％ (18/697)和0.93％ (5/539),4个年龄组间检出率总体差异有统计学意义(x2=8.809,P=0.032);(4)各地区HCoVs检出率高的年龄组为:华北0～1岁组(3.89％,7/180),西北0～1岁组(12.50％,3/24),东北0～1岁组(3.17％,2/63),华东1～3岁组(2.74％,9/328),西南0～1岁组(4.65％,12/258)和华南0～1岁组(2％,1/50);(5)8例HCoVs阳性的重症肺炎患儿中,6例为HCoVs单纯感染,其中3例伴有胸腔积液,2例并发急性呼吸衰竭.结论 HCoVs是儿童CAP的重要病毒病原之一;婴幼儿为HCoVs感染的高发人群;HCoVs感染可致重症肺炎,发生严重并发症.
