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EvaGreen多重荧光RT-PCR结合熔解曲线分析同时检测3种呼吸道病毒
目的 建立能同时检测甲型流感病毒 (Flu-A) 、乙型流感病毒 (Flu-B) 和鼻病毒 (HRV) 的Eva Green多重荧光RT-RCR熔解曲线分析方法.方法 针对Flu-A的M基因、Flu-B的NS1基因、HRV的5'NCR设计检测引物, 并使3个基因扩增产物的解链温度 (Tm值) 相差≥1.5℃.采用Eva Green新型荧光染料, 通过优化反应条件建立一步法多重RT-PCR反应体系.通过与商品化的荧光RT-PCR试剂盒的对照试验, 对新建方法进行性能验证.结果 3种病毒的PCR产物均获得特异性的熔解曲线峰, Tm值范围分别为:Flu-A, 85.085.5℃;Flu-B, 82.583.0℃;HRV, 88.589.5℃, 可以通过Tm值差异明显区分3种病毒.100份临床样本的性能验证显示, 新方法对3种病毒的检测均有较高的灵敏度、特异性和检验效能.结论 针对3种常见呼吸道病毒建立了基于Eva Green结合熔解曲线分析的多重荧光RT-PCR方法.该方法简便实用、成本低廉, 为喘息性疾病的临床诊断和病原谱研究奠定了方法学基础.
关键词： EvaGreen染料 多重荧光RT-PCR 熔解曲线 呼吸道病毒 -
EvaGreen 染料法实时定量PCR检测急性髓系白血病PRAME基因转录本
目的:采用实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)法检测急性髓系白血病(AML)中黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)基因转录本,初步评价其在AML中的临床意义. 方法:设计PRAME基因引物,建立扩增PRAME基因转录本的EvaGreen染料法RQ-PCR法,对PRAME转录本克隆质粒进行扩增,评价其特异性、重复性和灵敏性.并对10例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测. 结果:所建立的EvaGreen RQ-PCR法具有良好的特异性,低可检测到10个拷贝/μl的阳性模板,但其重复性差,而108～102拷贝/μl阳模的重复性良好.10例初诊AML患者PRAME转录本绝对含量为4.91×102～8.07×105拷贝/50ng(中位7.26×103拷贝/50ng),ABL标化后的相对含量为4.42%～13 170.01%(中位67.98%).而对照组8例缺铁性贫血患者中PRAME转录本相对含量为 0.00%～0.01% (中位0).1例AML患者诱导缓解后PRAME转录本下降,复发时又明显升高.结论: EvaGreen染料法RQ-PCR检测PRAME转录本方法敏感可靠,可用于AML患者临床监测.
关键词： 实时定量PCR EvaGreen染料 PRAME基因 急性髓系白血病 -
急性髓系白血病PRAME基因转录本的定量研究
目的 探讨黑色素瘤优先表达抗原(preferentially expressed antigen of melanoma,PRAME)基因转录本在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中的表达和临床意义.方法 建立荧光染料EvaGreen实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)对56例初诊AML患者和20例对照的骨髓单个核细胞标本中PRAME转录本进行检测,分析其临床相关性.结果 PRAME转录本含量在对照组和AML患者中分别为0～1.46%(中位0.18%)和0～21 618.09%(中位9.79%)(P＜0.01);FAB亚型中M1、M2、M3和M4患者中PRAME转录本含量较对照组明显增高,而M5患者与对照组差异无统计学意义.PRAME转录本含量与染色体预后分组显著负相关(r=-0.438,P=0.001),低危组患者中PRAME转录本含量显著高于中危组和高危组患者.AML-M2患者中t(8;21)易位阳性者PRAME转录本含量(135.06%～21 618.09%,中位2 201.88%)明显高于无t(8;21)易位者(0.14%～1696.30%,中位17.97%)(P=0.002).对1例AML患者不同阶段的标本检测发现诱导缓解后PRAME转录本明显下降,复发时又明显升高.结论 PRAME转录本在AML患者中高表达,是患者预后良好的一个标记,可用于AML患者的随访监测.
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EvaGreen实时定量PCR检测急性髓系白血病GRAF基因表达
目的 研究急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中粘着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子(GTPase regulator associated with the focal adhesion kinase,GRAF)基因的表达及其临床意义.方法 建立EvaGreen染料法实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RQ-PCR),对71例AML患者和21例良性血液病患者中GRAF转录本水平进行检测,分析其临床相关性.结果 所建立的EvaGreen RQ-PCR方法具有良好的特异性、重复性,敏感度达102拷贝/μL.AML患者中GRAF转录本水平(0.01%～169.75%,中位3.82%)较对照组(14.49%～126.85%,中位56.04%)显著降低(P<0.05),GRAF基因表达量与患者性别、年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、FAB亚型、染色体核型分组均无相关性(P>0.05).结论 AML患者中GRAF基因表达下调,可能与其发病有关.
