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环介导恒温扩增法快速检测寨卡病毒
目的 建立环介导恒温扩增(LAMP)方法快速检测寨卡病毒.方法 针对寨卡病毒NS5基因设计并筛选LAMP引物,优化反应条件,验证方法的特异性和灵敏度,通过实时浊度仪和钙黄绿素显色法判定结果.结果 针对寨卡病毒NS5基因的LAMP方法可在64℃50 min特异性扩增NS5基因,与基孔肯雅病毒、登革病毒、黄热病毒、甲型H1N1流感病毒均无交叉反应.检测灵敏度达到10拷贝/μl,是PCR方法的100倍.结论 LAMP方法快速检测寨卡病毒操作简便,适用于口岸现场快速检测.
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实时荧光恒温扩增技术检测乙型肝炎病毒基因型的研究
HBV感染呈全球流行趋势,严重危害了人类的身心健康.目前根据HBV基因全核苷酸序列异源性≥8％或S基因区核苷酸异源性≥4％将HBV毒株分为A～I九种不同基因型,HBV毒株在不同的地域流行趋势存在明显差异,我国主要流行B、C两种基因型[1-2].HBV基因型对HBV感染者的治疗以及预后判断具有重要意义,然而目前HBV基因分型检测方法存在操作繁琐或检测灵敏度不够理想等问题.为解决上述问题,我们根据HBV基因型序列特征,设计了B、C特异型的恒温扩增引物,同时结合SYBR Green Ⅰ荧光染料,建立了实时荧光恒温扩增技术检测HBV基因B、C型的实验方法.
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可视化环介导恒温扩增技术在日本血吸虫感染性钉螺检测中的应用研究
目的 建立一种方便、快速且灵敏度高、特异性强的日本血吸虫( SJ )感染性钉螺检测方法. 方法 PCR扩增SJ基因片段,并将其克隆到T载体构建阳性参照物;建立SJ核酸恒温扩增反应体系,并通过检测经等比稀释的阳性参照物和相关样本基因组DNA分析其灵敏度和特异性;设计相应的核酸纯化方法,组装SJ感染性钉螺检测试剂,并通过检测钉螺样本对其进行验证. 结果 获得长度213 bp的PCR扩增产物,并用该扩增产物构建了重组T载体,即阳性参照物;建立了SJ核酸恒温扩增反应体系,该体系可根据颜色变化判定扩增结果,且灵敏度和特异性良好;组装了SJ感染性钉螺检测试剂,该试剂可检测出含1%阳性钉螺的钉螺样本. 结论 成功建立了一种可视化的SJ感染性钉螺检测方法,并通过应用对其进行了验证.
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利用环介导恒温扩增法快速检测空肠弯曲菌
目的 利用环介导恒温扩增技术,以空肠弯曲菌的VS1基因设计引物,建立快速检测空肠弯曲菌的方法,以期能应用于急性腹泻和肠炎等疾病的快速检验.方法 ①通过基因比对与引物设计,设计针对空肠弯曲菌的环介导恒温扩增检测(LAMP)方法；②用钙黄绿素、亚甲基蓝、结晶紫、溴化乙锭4种DNA染料对扩增产物进行染色,评价各染料染色效果；③检测该LAMP方法对空肠弯曲菌及其他干扰菌的扩增情况,评价其特异性；④将该LAMP方法与培养法比较,进行统计学分析.结果 ①设计出针对空肠弯曲菌的LAMP检测方法；②钙黄绿素与扩增产物结合后颜色变化明显,是该LAMP方法中较好的DNA染料物质；③本LAMP检测方法只针对空肠弯曲菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性；④试验共检测了60株临床和标准菌株,对于菌株的培养物,LAMP检测结果与培养鉴定法比较差异无统计学意义(x2 =0.3333,P＞0.05).结论 本试验设计出了针对空肠弯曲菌LAMP检测方法,该LAMP法较好的DNA染料物质是钙黄绿素,该方法具有良好的特异性,与培养鉴定法比较具有较高的阳性、阴性及总体符合率,能够用于空肠弯曲菌的快速检验.
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利用环介导恒温扩增法快速检测溶组织梭菌
目的:利用环介导恒温扩增技术(LAMP),设计快速检测溶组织梭菌的方法,研究其反应特性,以期能应用于气性坏疽溶组织梭菌感染的临床现场检验.方法:通过基因比对与引物设计,设计针对溶组织梭菌的环介导恒温扩增检测方法.然后检测该方法对溶组织梭菌及其他干扰菌的扩增情况,对其特异性进行评价.检测该方法对不同浓度溶组织梭菌的扩增情况,对其灵敏度进行评价.后与全自动细菌培养法进行比较,评价其与常规检测方法的可比性.结果:本LAMP检测方法只针对溶组织梭菌有扩增,对其他15种菌不扩增,显示出良好的特异性.对溶组织梭菌的低检测限为1× 101CFU/ml,显示其灵敏度较高.与全自动细菌培养法相比,有良好的可比性(P＜0.05),很高的灵敏度(92.6％)、特异性(98.1％)及准确度(97.3％).结论:本试验设计出了针对溶组织梭菌的LAMP检测方法,该LAMP检测方法具有良好的特异性较高的灵敏度,能够用于溶组织梭菌的临床现场检验.
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基于LAMP技术建立解脲支原体基因试纸条检测方法
目的 建立一种灵敏度高、特异性强、检测速度快的方法检测解脲支原体.方法 基于环介导恒温扩增技术(LAMP),根据解脲支原体序列特征设计3对引物进行解脲支原体DNA切口酶核酸恒温扩增,扩增过程在一对引物中标记生物素,随着扩增的进行生物素直接引入扩增片段中,扩增结束后产物在密闭装置中进行免疫试纸条显色反应,根据显色卡的颜色判定结果的阴阳性.结果 该技术检测解脲支原体较实时荧光PCR技术灵敏度要高10倍以上,其它病原体检测均阴性该方法特异性与实时荧光PCR技术相当.结论 恒温扩增联合试纸条技术检测解脲支原体具有较高的敏感性和特异性,检测速度快,适合各医院开展.
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环介导恒温扩增(LAMP)技术及其在寄生虫检测中的应用
近年来开发出一种新的恒温核酸扩增方法,即环介导恒温扩增(loop-mediated isithermal amplification,LAMP)法.LAMP技术具有简便、快速、高效、特异性强等优点,尤其适用于人类和动物疾病的检测.该文简要介绍了LAMP技术的原理,并对其在检测寄生虫如锥虫、疟原虫、巴贝虫、隐孢子虫和水生动物孢子虫等方面的应用进行综述.
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恒温扩增芯片法在儿童下呼吸道感染性疾病中的应用价值评估
目的 评价恒温扩增芯片法在儿童下呼吸道感染病原体检测中的应用价值.方法 纳入2017年1～7月于首都医科大学附属北京儿童医院住院的下呼吸道感染患儿,入院当天采集痰液等分泌物标本,通过恒温扩增芯片法(芯片法)检测13种常见病原体,比较芯片法与痰培养和血清学方法的检出率.结果 研究期间应用恒温扩增芯片法共检测230例下呼吸道感染住院患儿,共检出182例(79.1％)病原阳性.单一病原感染77例(33.5％),混合感染105例(45.6％).芯片法检出的主要病原菌为耐甲氧西林葡萄球菌(33.8％)、流感嗜血杆菌(27.8％)和肺炎链球菌(22.6％),芯片法对流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的阳性检出率明显高于培养法.两种方法对于铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎支原体等的检出率差异无统计学意义.结论 对于儿童下呼吸道感染病原体检测,芯片法操作简便、快速,可同时检测13种病原体,且病原体检出率明显高于培养法.
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利用环介导恒温扩增16S rRNA对无乳链球菌快速鉴定的新方法
目的 建立用环介导恒温扩增16S rRNA对无乳链球菌鉴定的方法.方法 52株无乳链球菌和131株非无乳链球菌为研究对象,在无乳链球菌16S rRNA处设计4条特异性引物,对环介导恒温扩增的条件优化后,验证其特异性和敏感性.结果 52株无乳链球菌均能有效检出,没有任何非无乳链球菌的检出;环介导恒温扩增的低检出限为40CFU/ml,比普通的PCR高出100倍.结论 环介导恒温扩增16S rRNA,能方便、敏感、特异地完成对无乳链球菌的快速鉴定,适于基层机构使用.
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LAMP法检测牛奶中金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7
目的 建立一种能快速准确检测牛奶中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌O517:H7(Escherichia coli O517:H7)的环介导恒温扩增方法(loop mediated isothermal amplification,LAMP).方法以牛奶为研究对象,分别利用金黄色葡萄球菌nuc,鼠伤寒沙门菌invA和大肠杆菌O517:H7的rfbE保守基因设计LAMP特异引物,通过优化反应温度、时间等条件,建立检测牛奶中金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7的LAMP反应体系.并验证了本方法的特异性和灵敏度.结果 LAMP法对牛奶中金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7的灵敏度均为1.0×102拷贝/μL,比常规PCR灵敏度提高了10倍.金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O517:H7的LAMP反应条件为60℃、30min,鼠伤寒沙门菌为60℃、60min.利用SYBR Green I染料在紫外光下可直接观察检测结果,金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7阳性样品均呈绿色;进一步利用荧光定量PCR仪可检测到对应的扩增曲线.通过牛奶样品模拟掺杂实验,验证了方法的实用性和可靠性.结论 本研究建立的检测牛奶中金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌O517:H7的LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等特点,可用于牛奶中相关致病菌的检测,对预防和控制3种致病菌的传染有重要意义.
关键词： 环介导恒温扩增 金黄色葡萄球菌 鼠伤寒沙门菌 大肠杆菌O517:H7 -
环介导恒温扩增方法检测痰液标本中的肺炎链球菌
目的:建立在痰标本中应用环介导恒温扩增(LAMP)技术对肺炎链球菌进行快速检测的方法.方法:根据基因序列数据库(GenBank)上提交的肺炎链球菌R6株的lytA基因序列(登陆号AE008540)设计特异LAMP引物,对痰液标本进行LAMP法检测.同时进行传统微生物检测和PCR检测.结果:所有传统微生物检测肺炎链球菌阳性的27例标本在LAMP法检测和PCR检测中也为阳性,在传统微生物检测肺炎链球菌阴性的27例标本中LAMP法有9例检出阳性,PCR法有4例阳性,统计分析表明3种方法的阳性率没有显著性差异.结论:尽管3种方法的阳性率没有显著性差异,但由于LAMP法能够更加快速、简便地检出肺部的肺炎链球菌感染,所以LAMP法对快速诊断肺炎链球菌感染仍有重要的意义.
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环介导恒温扩增芯片法在机械通气新生儿下呼吸道病原菌检测中应用
目的 探讨环介导恒温扩增芯片法(LAMP)检测新生儿下呼吸道病原菌的可行性.方法 56例新生儿在机械通气48 h后采集下呼吸道痰标本,同时用LAMP法、细菌培养检测病原菌.结果 LAMP法阳性率明显高于培养法(46.43％ vs 26.79％,P＜0.05).LAMP法与培养法对耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌检测的阳性符合率一致(kappa＞0.4),而肺炎链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、阴沟杆菌、铜绿假单胞菌不一致(kappa＜0.4).结论 LAMP法检测痰标本中病原菌敏感性高于培养法,可指导合理使用抗生素.
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实时荧光环介导恒温扩增技术检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立
目的：建立嗜麦芽窄食单胞菌16S ribosomal RNA基因的实时荧光环介导恒温扩增（ RealAmp）快速检测方法，为嗜麦芽窄食单胞菌的快速检测提供一种新的方法。方法针对嗜麦芽窄食单胞菌16S ribosomal RNA基因设计的特异性引物，利用链置换DNA聚合酶（ Bst DNA polymerase ）恒温反应60 min，通过实时检测荧光信号来检测嗜麦芽窄食单胞菌16S ribosomal RNA基因的扩增。结果筛选实验发现：在使用引物4时，出峰时间短，故选择引物4进行后续实验操作。在11株相关菌株的检测中，除嗜麦芽窄食单胞菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。本研究检测嗜麦芽窄食单胞菌DNA的灵敏度可达到4．07×10－5 ng／μL。重复性分析表明：同一样品重复检测3次，几乎同时出峰，扩增曲线几乎重叠，说明RealAmp的重复性良好。结论嗜麦芽窄食单胞菌的RealAmp检测方法稳定性高，反应快速，特异性强，具有较大的推广及应用前景，可用于嗜麦芽窄食单胞菌的快速检测。
关键词： 嗜麦芽窄食单胞菌 环介导恒温扩增 实时荧光环介导恒温扩增 -
LA MP结合示差脉冲伏安法快速检测肺炎克雷伯菌的方法建立及临床应用
目的：利用环介导恒温扩增（LAMP）技术结合示差脉冲伏安（DPV）法，建立快速检测肺炎克雷伯菌的方法，并将其应用于小儿腹泻病原菌分析。方法通过基因比对与引物设计，建立针对肺炎克雷伯菌的LAMP 检测方法。采用LAMP 技术对肺炎克雷伯菌和其他8种干扰菌以及对不同浓度肺炎克雷伯菌进行扩增，结合DPV法评价其特异性及灵敏度。将200份腹泻患儿的粪便标本同时采用LAMP方法与培养法进行检验，对比2种方法检测肺炎克雷伯菌的阳性率。统计近2年该院门诊及住院小儿腹泻病例，初步分析其常见腹泻致病菌种类及比例。结果设计出针对肺炎克雷伯菌的LAMP 检测方法，该法只针对肺炎克雷伯菌有扩增，对其他干扰菌不扩增，显示出良好的特异性，LAMP法低检测限为10 CFU/mL，显示出较高的灵敏度。200份腹泻患儿粪便标本，采用LAMP法与培养鉴定法检测的肺炎克雷伯菌阳性率差异无统计学意义（P＞0．05）。近2年内该院小儿腹泻粪便标本中共检出致病菌709株，主要病原菌分别为志贺菌（34．23％）、大肠杆菌（15．40％）、铜绿假单胞菌（12．96％）、弗劳地枸橼酸杆菌（7．82％）、沙门菌（6．36％）、白色念珠菌（6．11％）、肺炎克雷伯菌（4．40％）、产气荚膜梭菌（3．67％）、变形杆菌（3．42％）、其他菌（5．63％）。结论设计出了针对肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法，该法具有良好的特异性和较高的灵敏度，能够用于肺炎克雷伯菌的快速检验。
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利用环介导恒温扩增法快速检测伤寒杆菌
目的 利用环介导恒温扩增技术(LAMP),设计快速检测伤寒杆菌的方法,研究其反应特性,以期能应用于临床现场检验.方法 (1)通过基因比对与引物设计,建立针对伤寒杆菌的LAMP检测方法.(2)根据该方法对伤寒杆菌及其他干扰菌进行检测时的扩增情况,对其特异性进行评价.(3)根据该LAMP方法对不同浓度伤寒杆菌的扩增情况,得出其低检测限,对其灵敏度进行评价.结果 该LAMP检测方法只针对伤寒杆菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性.该方法对伤寒杆菌的低检测限为1×101 CFU/mL,其灵敏度较高.结论 本试验设计出了针对伤寒杆菌的LAMP检测方法,该LAMP检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,能够用于伤寒杆菌的临床快速检测.
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基于环介导恒温扩增法快速检测破伤风梭菌
目的 利用环介导恒温扩增技术,设计快速检测破伤风梭菌的方法,以便对破伤风梭菌感染进行快速检测.方法 (1)设计针对破伤风梭菌的环介导恒温扩增检测方法.(2)对破伤风梭菌恒温扩增法进行特异性试验.(3)对破伤风梭菌恒温扩增法进行灵敏度试验.结果 (1)设计出针对破伤风梭菌的恒温扩增检测方法.(2)本恒温扩增检测方法只扩增破伤风梭菌DNA,对其他菌不扩增,显示出良好的特异性.(3)本恒温扩增检测方法的低检测限为1×101 CFU/25 μL,灵敏度高.结论 本试验设计的破伤风梭菌恒温扩增检测方法具有较高的灵敏度和特异性,简便、快速,适用于破伤风梭菌现场检验.
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快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究
目的 建立可用于粪便中艰难梭菌快速检测的环介导恒温扩增(LAMP)方法.方法 针对艰难梭菌毒素A基因,设计引物.采用LAMP对艰难梭菌和其他腹泻干扰菌及不同浓度艰难梭菌的扩增检测,对其特异性和灵敏度进行评价.同时采用LAMP和荧光定量PCR对100例疑似艰难梭菌感染的临床腹泻患者粪便进行检测,对两种方法进行比较.结果 LAMP对艰难梭菌及6种腹泻干扰菌的检测,只针对艰难梭菌有扩增,显示了较好的特异性.LAMP低检测限为10 CFU/mL,灵敏度较高.对100例临床粪便标本LAMP检测结果与荧光定量PCR比较差异无统计学意义(P＞0.05,χ2=0.142 9).结论 本研究建立的粪便中艰难梭菌的LAMP快速检测方法特异性好、灵敏度较高、操作简便,适用于艰难梭菌的临床快速检测及现场检测.
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利用环介导恒温扩增法快速检测溶组织梭菌
目的 利用环介导恒温扩增技术,设计快速检测溶组织梭菌的方法,研究其反应特性,以期能应用于气性坏疽临床现场检验.方法 通过基因比对与引物设计,设计针对溶组织梭菌的环介导恒温扩增检测(LAMP)方法.检测该LAMP方法对溶组织梭菌及其他干扰菌的扩增情况,对其特异性进行评价.(3)检测该LAMP方法对不同浓度溶组织梭菌的扩增情况,观察其低检测限,对其灵敏度进行评价.结果 设计出针对溶组织梭菌的LAMP检测方法.该LAMP检测方法只针对溶组织梭菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性.该LAMP检测方法对溶组织梭菌的低检测限为1×101 CFU/mL,显示其灵敏度较高.结论 该试验设计出了针对溶组织梭菌的LAMP检测方法,该LAMP检测方法具有良好的特异性较高的灵敏度,能够用于溶组织梭菌的临床现场检验.
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艰难梭菌感染分子诊断研究现状及进展
艰难梭菌是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌，在自然环境、动物以及人体肠道中广泛存在，是人体肠道的正常菌群。1935年在新生儿肠道发现，1978年确定与伪膜性肠炎有关，但直到2003年在北美引起大流行，艰难梭菌感染（CDI）才开始引起医务人员的重视。现已确定，艰难梭菌是医院感染性腹泻的主要病原菌，25％～33％的抗菌药物相关性腹泻、90％的伪膜性肠炎与之有关。CDI的疾病谱非常广泛，包括无症状携带者、自限性腹泻到中度腹泻、伪膜性肠炎，甚至是危及生命的暴发性肠炎。近年来，由于广谱抗菌药物的大量使用，放、化疗和质子泵抑制剂的使用，以及鼻胃管、灌肠等侵入性操作，艰难梭菌的感染率不断上升，尤其是自2003年北美发现高毒力菌株核糖体027型以来，因其具有更高的毒素量、更强的耐药性及传染性，感染者疾病的严重程度上升，治疗难度增加，治疗费用提高，给患者和医务人员造成了极大的挑战。快速、准确诊断CDI ，不但可以使患者获益，还能防止其在人群中引起暴发流行。早期的诊断主要靠细胞培养毒素中和实验和产毒菌株培养，但这两种方法耗时长、技术要求高，现多用于新方法的评估；直接针对细菌毒素 tcdA和／或tcdB的酶联免疫法（EIAs）因简单、快捷曾一度受到大多数实验室的青睐，但后来发现因毒素分解、表位改变等导致其敏感性不够；于是，针对细菌毒素基因tcdA、tcdB以及二元毒素基因cdt、毒素调节基因tcdC ，敏感性高、特异性好、省时又省力的核酸扩增方法开始引起重视。近年来美国食品药品监督管理局（FD A ）批准的核酸扩增方法就有10余种，很多实验室也建立了自己的实验方法。本文就近年来艰难梭菌的核酸扩增方法进行了详细阐述。
关键词： 艰难梭菌 核酸扩增 聚合酶链反应 环介导恒温扩增 依赖解旋酶的恒温扩增 -
基于颜色判定的环介导恒温扩增技术快速检测铜绿假单胞菌的研究
目的 建立了一种基于颜色判定的,能够快速准确地检测铜绿假单胞菌的LAMP方法.方法 针对铜绿假单胞菌OprL基因设计3对LAMP引物,通过引物特异性识别OprL的8个独立区域来快速检测铜绿假单胞菌.如果在反应前添加荧光染料羟基萘酚蓝(HNB)或钙黄绿素(Calcein),其结果可以通过肉眼观察反应前后颜色变化来判定并经琼脂糖凝胶电泳验证.对该技术进行特异性、灵敏度分析,利用LAMP和PCR同时检测临床标本.结果 设计出针对铜绿假单胞菌OprL基因的恒温扩增检测方法.本恒温扩增检测法只扩增铜绿假单胞菌DNA,对其他菌不扩增,显示出良好的特异性.其低检测限为17.414 pg/μl,PCR方法低检出限为174.414 pg/μl,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,灵敏度高.LAMP法对临床阳性标本检出率与PCR法相当(27/27).结论 LAMP方法用于快速检测铜绿假单胞菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断.
