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EvaGreen多重荧光RT-PCR结合熔解曲线分析同时检测3种呼吸道病毒
目的 建立能同时检测甲型流感病毒 (Flu-A) 、乙型流感病毒 (Flu-B) 和鼻病毒 (HRV) 的Eva Green多重荧光RT-RCR熔解曲线分析方法.方法 针对Flu-A的M基因、Flu-B的NS1基因、HRV的5'NCR设计检测引物, 并使3个基因扩增产物的解链温度 (Tm值) 相差≥1.5℃.采用Eva Green新型荧光染料, 通过优化反应条件建立一步法多重RT-PCR反应体系.通过与商品化的荧光RT-PCR试剂盒的对照试验, 对新建方法进行性能验证.结果 3种病毒的PCR产物均获得特异性的熔解曲线峰, Tm值范围分别为:Flu-A, 85.085.5℃;Flu-B, 82.583.0℃;HRV, 88.589.5℃, 可以通过Tm值差异明显区分3种病毒.100份临床样本的性能验证显示, 新方法对3种病毒的检测均有较高的灵敏度、特异性和检验效能.结论 针对3种常见呼吸道病毒建立了基于Eva Green结合熔解曲线分析的多重荧光RT-PCR方法.该方法简便实用、成本低廉, 为喘息性疾病的临床诊断和病原谱研究奠定了方法学基础.
关键词： EvaGreen染料 多重荧光RT-PCR 熔解曲线 呼吸道病毒 -
新型H7N9亚型禽流感病毒多重荧光RT-PCR快速检测方法的建立
为研制新型H7N9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒,根据GenBank中公布的新型H7N9亚型(2013年)禽流感病毒血凝素抗原(HA)和神经氨酸酶抗原(NA)的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的多重荧光RT-PCR快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒方法.实验结果表明,该方法灵敏度高、特异性好,能够检测到低浓度为10拷贝/μL数量级的阳性标准品,不但能够将禽流感病毒H7亚型与H1、H3、H5、H6和H9亚型区分开,而且可将新型N9亚型禽流感病毒与原有的N9亚型区分开.采用该方法对珠海市2 700份样品的检测结果与预期结果一致,证实该方法具有较好的推广应用前景.
关键词： 新型H7N9 多重荧光RT-PCR 快速检测 -
含内质控多重荧光RT-PCR同时检测麻疹病毒和风疹病毒的研究
由于从临床症状上难以区分麻疹病毒或风疹病毒引起的人群急性发热出疹性传染病,故而分别设计针对麻疹病毒和风疹病毒的特异性引物和荧光标记探针,建立含内质控的多重荧光RT-PCR以同时检测麻疹病毒和风疹病毒的核酸.结果表明:建立的多重荧光RT-PCR方法特异性好,试验验证没有出现假阳性和假阴性现象;该方法的灵敏度高,对麻疹病毒和风疹病毒的低检出限分别达到0.1TCID_(50)/mL,和1TCID_(50)/mL,可从疑似患者咽拭子等标本中直接检测到病毒核酸;同时该方法具有良好的稳定性,当分别用0.1～10~3 TCID_(50)/mL麻疹和风疹病毒的样本进行重复试验时,其CT值变异系数均在0.9%以下.此外,以人核糖核酸酶P(RNase P)作为内质控,可以有效监控临床标本的采样质量及因操作失误等所致的假阴性结果出现.本方法尤其适用于疑似麻疹或风疹暴发疫情的临床快速诊断.
关键词： 麻疹病毒 风疹病毒 RNase P 多重荧光RT-PCR 内质控 -
检测柯萨奇病毒A组6、10、16型的多重荧光RT-PCR建立及应用
目的 建立检测手足口病(HFMD)肠道病毒的多重荧光RT-PCR方法.方法 用多重荧光RT-PCR技术对引起HFMD的3种常见人肠道病毒[柯萨奇病毒A组(CVA)6、10、16型]进行检测,用基因测序法进行验证,并以灭活的CVA6、CVA10、CVA16病毒标准株以及引起临床相似症状的病原体样本进行特异性和灵敏度分析.结果 322例临床疑似HFMD标本,经本多重荧光RT-PCR法检测出CVA16、CVA10和CVA6型阳性样本分别为81、16和9份(总阳性率32.9％),且与基因测序法结果完全符合.将多重PCR体系中c-MMLV逆转录酶的量增至5U,Hot-Taq酶的量增至8.5U,可使其扩增效率提升至单重PCR扩增水平.优化后的体系可扩增出CVA6、CVA10和CVA16型阳性病毒标准RNA的检测下限分别是10,5和1 TCID50/mL.结论 建立了一种灵敏、特异、高效和高通量的检测HFMD肠道病毒的多重荧光RT-PCR法,为其快速诊断提供了新的实验方法.
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多重荧光 RT-PCR同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒方法的建立
目的 建立可同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的双重荧光RT-PCR快速检测方法,并应用于临床标本的检测.方法 使用针对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒各亚型代表株保守序列设计的特异性引物和TaqMan探针,通过调整引物、探针浓度优化佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系.对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行评估,并对临床粪便标本进行检测,与已有的单重荧光RT-PCR方法进行比较.结果 实验结果表明,该检测方法特异性强,对GⅠ型、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒进行检测,均无交叉反应;对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒核酸的低检出限分别可达1pg/mL和10pg/mL,并且重复性好;对101份临床标本分别用已有的单重荧光RT-PCR和本文建立的多重荧光RT-PCR进行检测,结果显示本文建立的多重荧光RT-PCR方法对GI型诺如病毒的检测能力优于前者.结论 本研究建立的多重荧光RT-PCR方法能同时对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒进行快速检测,并且灵敏度高,特异性好,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速检测.
关键词： 诺如病毒 多重荧光RT-PCR 检测 GⅠ型 GⅡ型 -
多重荧光RT-PCR在手足口病病原检测中的应用分析
目的 多重荧光RT-PCR技术能有效地进行手足口病病原检测.方法 应用多重荧光RT-PCR技术,对疑似临床重症、轻症手足口病病例进行病原检测,包括肠道通用病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型进行检测.结果 通过对584个病例,851件样本的检测.其中24个病例EV阳性(未分型),占4.38％;285个病例EV71阳性,占52.01％;120个病例CoxAl6阳性,占21.90％;其余核酸检测结果为阴性.其检测结果与普通荧光RT-PCR差异无统计学意义(P＞0.05).结论 多重荧光RT-PCR可应用于手足口病病原监测及应急检测工作,尤其是在大样本量的情况下,不仅在一定程度上可以减少耗材的支出,而且可以有效减少人力支出.
关键词： 手足口病 多重荧光RT-PCR 应用分析 -
甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法的建立
目的 构建一种可同时检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法.方法 根据不同流感亚型HA与NA的差异,设计五对引物及五条探针,构建合适的检测体系,分析特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,并将其与常用检测试剂盒进行比对.结果 本研究成功构建多重荧光RT-PCR检测体系,能同时检出甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒,检测灵敏度为101～102拷贝/μl,可重复性好(变异系数为0.47％～4.03％),比常用检测试剂具有更好的荧光值水平,可适用于多种常见的荧光定量PCR仪.结论 本方法所构建检测流感亚型体系具有较好的特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,适用于各基层疾控及医疗机构.
关键词： 多重荧光RT-PCR 流感 H1N1 H3N2 检测 -
常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法的建立及临床应用
目的 建立能同时检测病毒性腹泻患者粪便中星状病毒(astrovirus)、A族轮状病毒(group A rotavirus)、肠道腺病毒(enteric adenovirus)、诺如病毒 GⅠ/GⅡ(norovirus GⅠ/GⅡ)的多重荧光RT-PCR方法.方法 根据各病毒基因组保守性序列设计引物和探针,建立多重荧光RT-PCR检测方法.对建立的多重荧光RT-PCR方法 进行特异性、敏感性及灵敏性实验,并使用该法对256份病毒性腹泻粪便标本进行检测,同时使用基因测序进行验证.结果 成功建立常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法,对星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒以外的病原体不发生扩增反应.该法检测星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒的灵敏度可达500 copies/mL.256份标本中:星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒和诺如病毒阳性率分别为3.12%(8/256)、42.97%(110/256)、9.38%(24/256)和10.16%(26/256),与基因测序方法 检测结果 符合率达到100%.结论 该多重荧光RT-PCR检测方法 具有快速、灵敏、特异的优点,可用于临床病原诊断.
关键词： 星状病毒 轮状病毒 肠道腺病毒 诺如病毒 多重荧光RT-PCR
