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小鼠淋巴瘤细胞基因突变方法的建立与应用
小鼠淋巴瘤试验(mouse lymphoma assay,MLA)是近几年发展起来的一种新的遗传毒性的评价方法,由于其特有的优点,目前MLA的"软琼脂"法和"微孔板"法,均被欧洲合作和发展组织(OECD)、人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)认可.
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昆明山海棠总生物碱诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究
目的:研究昆明山海棠(THH)总生物碱对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞tk基因的影响.方法:用抽提的THH总生物碱对L5178Y细胞进行浓度梯度染毒,不同时间点进行单细胞微孔接种,计数阳性集落,测定细胞接种效率、相对存活率、相对悬浮增长率和突变频率.结果:随着THH总生物碱作用剂量的增加,L5178Y细胞相对存活率和相对悬浮增长率均明显下降;在0.1～2.0 g*L-1范围内可诱导细胞tk位点的突变,诱发突变频率是自发突变频率的2～9倍.在tk位点诱发了两种不同表型的突变集落,即大集落与小集落,但以大集落为主,这一现象可能与THH的作用机制有关.结论:THH总生物碱对L5178Y细胞具有肯定的细胞毒性与诱导基因突变作用.
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染料木素的抗诱变性检测
目的：评价染料木素的抗诱变性。方法培养L5178Y细胞,根据不同的处理方法进行分组,阳性诱变组[染料木素0.078、0.156、0.312、0.625μg/mL 4种剂量分别联合甲基磺酸甲酯(MMS)5μg/mL或丝裂霉素C(MMC)0.5μg/mL]、阳性诱变对照组(MMS 5μg/mL或MMC 0.5μg/mL)、溶剂对照组(0.5%二甲基亚砜)、阴性对照组(纯水)以及抗诱变阳性对照组(维生素C 100μg/mL+MMS 5μg/mL或MMC 0.5μg/mL)。通过L5178Y小鼠淋巴瘤细胞实验微孔板法,采用前处理(染料木素先处理细胞3 h,然后MMS或MMC处理3 h)、同时处理(染料木素与MMS或MMC同时处理细胞3 h)和后处理(MMS或MMC先处理细胞3 h,然后染料木素处理3 h)3种处理方式,测定染料木素各剂量组tk位点突变频率,评价染料木素对MMS或MMC诱变性的拮抗作用。结果在染料木素抗诱变性检测中,在前处理和后处理条件下,染料木素各剂量组tk位点总突变频率显著低于MMS或MMC阳性诱变对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01)；在同时处理条件下,染料木素0.312、0.625μg/mL剂量组tk位点总突变频率显著低于MMS或MMC阳性诱变对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论在3种处理方式下,染料木素能有效地抑制MMS和MMC的诱变作用,以前处理方式的抑制作用强,有良好的开发利用前景。
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硝酸羟胺诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因杂合性缺失分析
目的 探讨tk基因分子突变的类型,对不同剂量硝酸羟胺诱导小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk+/-细胞tk基因突变的杂合缺失进行分析.方法 使用硝酸羟胺50～500 mg/L剂量对L5178Y细胞进行梯度染毒,分别测定细胞毒性,细胞接种效率,相对悬浮生长率和突变频率.挑选经硝酸羟胺诱导的tk基因突变子(tk-/-)和自发突变体,提取基因组DNA,经等位基因特异性PCR扩增,杂合性缺失(LOH)分析等技术,分析其杂合性缺失的发生.结果 大集落和小集落诱导突变体tk基因LOH发生率分别为62.2%和98.9%.由LOH分析的实验结果显示,诱导突变体的LOH在LC与SC之间差异具有统计学意义(P<0.05).结论 功能性等位基因缺失是HAN诱导tk基因分子突变的重要形式之一,在不同集落类型之间可能具有不同的突变机制.
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高能微波辐射对小鼠淋巴瘤细胞的影响
目的 研究高能微波(HPM)对小鼠淋巴瘤L5178Y 3.2.7c-tk+/-细胞的影响,以明确高能微波的致突变性和细胞毒性.方法 微波频率为7.9 GHz,功率为10.0 mW/cm2,以不同的时间(0～75 min)辐照L5178Y细胞,分别进行细胞毒性、细胞接种效率、相对悬浮生长率和tk基因突变率的测定.结果 随微波照射时间的延长,L5178Y细胞的相对存活率和悬浮生长率明显降低,照射75 min时分别降低51.4%和89.7%.长照射时间诱导L5178Y细胞tk基因的突变率是阴性对照突变率1.5倍,尚未达到2倍,未见明显致突变性.结论 HPM对L5178Y细胞具有明显的细胞毒性,但未见明显诱导tk基因突变.
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乙基亚硝基脲诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因杂合性缺失
目的 探讨tk基因分子突变的类型,对不同剂量乙基亚硝基脲(ENU)诱导小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk+/-细胞tk基因突变的杂合性缺失(LOH)进行分析,为环境致突变荆检测和突变机制研究提供依据.方法 使用乙基亚硝基脲10μg/mL和100μg/mL剂量对L5178Y细胞进行梯度染毒,分别测定细胞毒性、细胞接种效率、相对存活率、相对悬浮生长率和突变频率等.挑选经ENU诱导的tk基因突变子(tk-/-)和自发突变体,提取基因组DNA,应用等位基因特异性PCR扩增、杂合性缺失分析等技术,分析其杂合性缺失的发生.结果 低剂量和高剂量诱导突变体的tk基因LOH发生率分别为73.5%和69.1%.LOH分析结果 显示,诱导突变体的LOH在大集落与小集落之间差异具有显著性(P＜0.05).结论 功能性等位基因缺失是ENU诱导tk基因分子突变的重要形式之一,不同剂量可能具有不同的突变机制.
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大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用
目的 评价大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用.方法 小鼠淋巴瘤细胞在代谢活化或非代谢活化条件下暴露于50、200、350、500 μg/mL.大黄酸3 h,处理后第2天将细胞接种于含有突变选择剂三氟胸苷的96孔板中,计数各剂量组的突变细胞集落数.通过计算第0天的相对存活率(relative survival,RS)、相对悬浮增长率(relatire suspension growth,RSG)和相对总增长率(relative total growth,RTG)确定细胞毒性.用MUTANT软件包计算各种细胞毒性参数和突变率,并对突变率数据进行统计分析.结果 在非代谢活化条件下,50、200、350、500 μg/mL的大黄酸均未见诱导L5178Y细胞的突变率增加,阳性对照组诱导的突变率显著增加;在代谢活化条件下,大黄酸350 μg/mL,剂量组诱导L5178Y细胞的突变率增加,阳性对照组诱导的突变率显著增加.结论 在非代谢活化条件下大黄酸各剂量组对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因无致突变作用;在肝微粒体酶系S9代谢活化条件下,出现了弱致突变性.
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茶多酚对60Coγ射线诱导L5178Y细胞凋亡及氧化应激的保护作用
目的 探讨茶多酚(tea polyphenols,TP)对60Coγ射线诱导L5178Y细胞凋亡和细胞内活性氧水平(reactive oxygen species,ROS)的作用.方法 L5178Y细胞分为空白对照组、60Coγ射线辐照组、TP组及辐照加TP组共4组,TP组及辐照加TP组培养同时加入茶多酚终浓度分别为25、50、100 μg/mL,60 Coγ射线辐照组及辐射加TP组细胞给予8 Gy60Coγ射线一次性照射后,采用DCHF-DA探针测定细胞内活性氧(ROS)水平,Annexin V-FITC/PI双染和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡.结果 8 Gy60Coγ射线照射后4h,细胞活力明显降低,出现典型的细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳显示出现凋亡梯状条带,并伴随细胞内ROS水平明显升高,茶多酚能明显改善这些反应,TP处理组与辐照组相比有统计学差异(P＜0.01).结论 茶多酚能显著降低60Coγ射线诱导的L5178Y细胞内活性氧产生,降低细胞凋亡率,对γ射线照射有一定的保护作用.
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小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验检测阿特拉津的诱变性
目的 了解除草剂特拉津是否具有诱变性.方法 采用小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验,设6.25、12.5、25、50、100 μg/ml 5个剂量组,不加S9条件下处理L5178Y细胞3h和12h,加S9条件下处理细胞3h,分别进行细胞毒性和突变频率的测定.结果 随阿特拉津染毒剂量的增加,3种处理条件下各剂量组的相对存活率(RV)和相对悬浮增长率(RSG)均降低,突变频率增高,且有剂量反应关系；在100 μg/ml剂量组L5178Y细胞tk位点突变频率与溶剂对照组自发突变频率相比差异有统计学意义.结论 阿特拉津对L5178Y细胞有明显的细胞毒性和一定的遗传毒性.
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小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验检测染料木素的诱变性
目的:用小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验检测染料木素的诱变性.方法:不加S9活化的条件下,用染料木素5、10、15、20μg/ml处理L5178Y细胞3 h,采用微孔板法进行细胞毒性、平板接种效率和突变频率测定.结果:随染毒剂量的增加,染料木素对L5178Y的细胞毒性增大.染料木素能诱发L5178Y细胞tk位点突变频率显著增高,当剂量达到15μg/ml以上时其诱发突变频率为自发突变的3倍以上.结论:染料木素对L5178Y细胞有明显的细胞毒性,并可诱发tk基因突变.
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L5178Y和WTK1细胞微核试验在抗诱变测试中的应用
为了研究L5178Y和WTK1细胞应用于抗诱变测试系统的可靠性和有效性,按维生素C(Vc)和叶绿酸铜钠(Chl)与丝裂霉素C(MMC)的加入顺序,分为同时处理、预处理和后处理三种处理方式,观察Vc和Chl对MMC诱导两种细胞微核的抑制作用.结果表明:①Vc和Chl本身无诱导两种细胞微核的作用;②Vc与MMC同时处理和预处理,能显著降低MMC诱导的两种细胞微核率;③0.12mg/ml Chl与MMC同时处理和预处理,能显著降低MMC诱导的两种细胞微核率,但0.06mg/ml同时处理和预处理仅能显著降低MMC诱导的WTK1细胞微核率.后处理方式对微核反应无抑制作用.该研究结果与Vc和Chl在其它抗诱变试验中的结果基本一致,表明L5178Y和WTK1细胞微核试验在抗诱变作用检测方面有较好的应用价值.
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丙烯酰胺诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究
背景与目的:研究丙烯酰胺(Acrylamide,AA)对小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk+/-细胞tk基因突变频率的影响.材料与方法:使用丙烯酰胺对L5178Y细胞进行梯度染毒,分别进行细胞毒性,细胞接种效率,相对悬浮生长率和突变频率的测定.结果:随着AA剂量的增加,L5178Y细胞的相对存活率和悬浮生长率均明显降低.在150～750 μg/ml范围内诱导L5178Y细胞tk基因的突变频率高于自发突变频率1～9倍,表明具有较强的致突变性.结论:AA对L5178Y细胞具有明显的细胞毒性,并可以诱导tk基因的突变.
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tk基因突变的分子机制研究
胸苷激酶 (Thymidine kinase, tk)基因突变试验是对外源性化学物质进行遗传毒性检测的短期试验方法.该方法可检测出染色体 tk位点的点突变、基因缺失以及染色体畸变等多种类型的遗传损伤.遗传毒性物质作用于 tk位点产生大、小两种突变体,对应着不同的突变机制.杂合子丢失的产生机制和 P53基因的作用机制是近年来研究的热点.
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芦荟大黄素及芦荟提取物的诱变性和抗诱变性
目的:用L5178Y小鼠淋巴瘤细胞体外微核试验评价芦荟大黄素和芦荟提取物的诱变和抗诱变作用,为其安全性评价提供依据.方法:设溶剂对照、阳性对照和抗诱变对照,芦荟大黄素和芦荟提取物诱变和抗诱变试验各设4个剂量组,处理L5178Y细胞12h后按常规方法进行体外微核试验分析.结果:较高浓度(6.67μg/ml)的芦荟大黄素可致微核细胞率增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；而芦荟提取物未见此效应.在一定剂量范围内,芦荟大黄素(0.22～6μg/ml)和芦荟提取物(20～180μg/ml)对甲磺酸甲酯(MMS)所致微核细胞率均有一定程度的拮抗作用,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:芦荟大黄素具有一定的诱变作用,而在本实验剂量范围内的芦荟提取物未见遗传毒性.两种受试物在一定范围内均能较好地拮抗MMS所致的染色体损伤.
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硝酸羟胺诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究
背景与目的:研究硝酸羟胺对小鼠淋巴瘤L5178Y-3.7.2c tk+/-细胞tk基因突变的影响.材料与方法:使用硝酸羟胺对L5178Y细胞进行梯度染毒,再分别进行细胞毒性,细胞接种效率,相对存活率,相对悬浮生长率和突变频率测定.结果:随着硝酸羟胺的剂量增加,L5178Y细胞的相对存活率和悬浮生长率均下降.在硝酸羟胺50～500μg/ml范围内可以诱导细胞tk基因的突变率达到自发突变率几倍至十几倍.结论:硝酸羟胺对L5178Y细胞具有明显的细胞毒性,并可以诱导tk基因突变.
