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蛋白磷酸酶2A催化亚基异构体过表达细胞株的构建和鉴定
目的 克隆PP2Acα异构体(PP2Acα2)并分析该基因结构,构建PP2Acα2和PP2Acα载体并建立高表达细胞株.方法 诱导HL-60细胞表达PP2Acα2,克隆PP2Acα2和PP2Acα使用pCMV-Tag4A真核表达载体构建重组质粒.通过转染建立高表达细胞株,RT-PCR和蛋白免疫印迹实验检测其PP2Acα2、PP2Acα基因和蛋白水平,使用细胞计数法检测细胞株生长曲线和流式细胞仪检测细胞周期.蛋白免疫印迹实验检测免疫球蛋白结合蛋白1(IGBP1)在构建成功的细胞中的改变.结果 经过测序鉴定PP2Acα2和PP2Acα重组质粒构建成功,PP2Acα2为PP2Acα剪切异构体缺失第五外显子.RT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示成功构建表达PP2Acα和PP2Acα2的HEK293细胞株.转染后的细胞生长曲线和细胞周期未发生明显改变.IGBP1在转染了PP2Acα2的HEK293细胞株中表达量分别是Vetor组和PP2Acα组的2.2倍和1.5倍.结论 成功克隆了PP2Acα2基因并构建了重组质粒,成功构建了高表达PP2Acα2细胞株.为阐明PP2Acα2的作用机制及其生物学效应提供了可靠的平台.
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PD-L2剪切异构体与EGFP融合蛋白的表达及其亚细胞定位研究
目的探讨PD-L2的剪切异构体在哺乳动物细胞的表达和亚细胞定位. 方法以RT-PCR方法克隆人PD-L2基因的常规剪切体和新型剪切异构体的cDNA,构建其与EGFP融合的表达载体,分别转染K562细胞进行表达,经抗PD-L2抗体染色后以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位. 结果从活化的人白细胞中克隆到常规剪切体PD-L2Ⅰ和新型剪切异构体PD-L2Ⅱ的cDNA, 后者删除了编码胞外区Ig-C结构域的外显子3.进而构建了PD-L2Ⅰ-EGFP和PD-L2Ⅱ-EGFP融合蛋白表达载体,分别转染K562细胞.流式细胞仪分析显示,转染前者的细胞中既可检测到EGFP的表达又可在细胞膜上检测到PD-L2表达;而转染后者的细胞中只能检测到EGFP的表达,在其细胞膜上不能检测到PD-L2表达.共聚焦显微镜观察显示,PD-L2Ⅰ-EGFP主要分布于细胞膜表面,PD-L2Ⅱ-EGFP则主要分布于细胞内. 结论常规剪切体PD-L2Ⅰ能正确定位于细胞膜表面,而新型剪切异构体PD-L2Ⅱ则位于细胞内,不能运输至细胞膜,提示不同PD-L2剪切异构体可能与其功能的调变有关.
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耳蜗α1D L-型电压门控钙通道剪切异构体的克隆和体外表达研究
目的 克隆大鼠耳蜗毛细胞电压门控钙通道α1D剪切异构体并在体外表达.方法 以耳蜗基底膜中组织总RNA为模板,利用长距离RT-PCR克隆耳蜗毛细胞表达的电压门控钙通道α1D剪切异构体,并利用异源表达系统在哺乳动物细胞系进行表达.结果 克隆的耳蜗毛细胞表达的α1D剪切异构体全长cDNA长达6.2kb,构建了哺乳动物表达载体,建立了稳定表达该剪切异构体的细胞系.结论 内耳毛细胞表达组织特异性的α1D剪切异构体,该异构体在外源表达系统中的表达为今后研究耳蜗α1D L-型钙通道蛋白的电生理和药理特性奠定了基础.
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小鼠结肠平滑肌大电导钙激活钾通道的剪切与表达
目的 检测小鼠结肠平滑肌大电导钙激活钾通道(large conductance calcium activated potassium channels,BKCa)mRNA的全长结构,探明该基因在结肠平滑肌的剪切形式,并对BKCaα亚基在消化道各节段的表达进行半定量比较.方法 采用RT-PCR和Western blotting方法 检测消化道各段平滑肌BKCa基因和蛋白的表达,用RT-PCR的方法 分段检测小鼠结肠平滑肌上BKCa基因各个剪切位点的剪切形式.结果 在小鼠无论在mRNA还是在蛋白水平,胃和结肠平滑肌BKCa的表达均比十二指肠、回肠部位丰富.结肠平滑肌上BKCa α亚基mRNA缺失第19号外显子即应激调控外显子(stress-regulated exon,STREX),在其他位点未检测到外显子剪切.结论 在小鼠消化道各节段,结肠平滑肌上BKCa的含量比较高,其α亚基未表达第19号外显子序列,其表型为缺失应激调控外显子型,即ZERO型.
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Mamu-B*007:03及其剪切异构体Mamu-B*007:03-sv1基因的表达与细胞内定位
目的 Mamu-B* 007:03-sv1是中国恒河猴主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子的一种剪切异构体,其α3结构域缺失.本实验初步获得其在细胞内的表达和定位信息,并与全长的Mamu-B* 007:03基因的表达情况进行比较.方法 分别构建Mamu-B* 007:03-sv1-myc-pEGFPN3和Mamu-B*007:03-myc-pEGFPN3的真核表达载体,并将这两种重组质粒分别转染293T细胞.利用Western-blot免疫印迹实验检测这两种基因在细胞内的表达情况,并利用激光共聚焦显微镜技术分别分析这两种基因在细胞内的表达定位.结果 Mamu-B* 007:03-sv1和Mamu-B* 007:03基因均能在293T细胞内正常表达.Mamu-B* 007:03-sv1发生了糖基化的修饰,Mamu-B*007:03基因在细胞膜上表达,Mamu-B * 007:03-sv1基因在细胞内表达.结论 Mamu-B* 007:03-sv1基因的α3结构域缺失,其细胞内的表达和定位与全长Mamu-B* 007:03基因有明显差异,其功能有待于进一步探索.
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棕头蜘蛛猴Atfu-B基因α2结构域缺失剪切异构体的表达及其细胞内定位
目的 Atfu-B*sv1是棕头蜘蛛猴主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)I类分子的一种剪切异构体,其α2结构域缺失.本实验旨在初步获得其在细胞内的表达和定位信息,并与全长的Atfu-B基因的表达情况进行比较,观察两者之间的差异.方法 分别构建Atfu-B * sv1以及全长Atfu-B基因Atfu-B * 02:03和Atfu-B * 03:01的真核表达载体,并将这三种重组质粒分别转染293T细胞.利用Western blot免疫印迹实验检测这三种基因在细胞内的表达情况,并利用免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术分别分析这三种基因在细胞内的表达定位.结果 Atfu-B * sv1、Atfu-B * 02:03和Atfu-B * 03:01均能在293T细胞内正常表达,并且都发生了糖基化的修饰,三种基因都在细胞膜上表达.结论 虽然Atfu-B * sv1的α2结构域缺失,但其细胞内的表达和定位与全长全长Atfu-B基因没有明显差异,其功能有待于进一步探索.
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神经病理性痛对大鼠脊髓水平GABAB受体亚型蛋白表达的影响
大量的研究表明,神经病理性痛等慢性疼痛状态可导致脊髓背角一系列神经递质和神经递质受体系统发生改变.GABAB受体的改变能影响机体GABA能系统的功能,从而影响痛觉信息在脊髓背角的整合、传递和调控.GABAB受体以其两个亚型(GABAB1、GABAB2)的异二聚体形式存在并发挥功能[1,2],但新研究显示GABAB2单独也可以构成功能性的受体[3].GABAB1a和GABAB1b是GABAB1主要的两个剪切异构体.对GABAB受体各亚型在神经病理性痛中的变化进行研究,将有助于更好地了解和阐明GABAB受体和GABA转运体在神经病理性痛发生、发展中的功能,以期发现更具有针对性的疼痛治疗的靶点.
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survivin亚细胞定位与卵巢癌关系的研究进展
survivin及其剪切异构体参与了控制细胞分裂和抑制细胞凋亡.它在正常成人组织不表达,在多种肿瘤组织中高表达,使其成为肿瘤标志物和抗癌治疗中一项具有吸引力的研究目标.近年,survivin亚细胞定位与肿瘤的关系成了研究热点,现就survivin及其剪切异构体的亚细胞定位及其与卵巢癌关系的研究进展作一综述.
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抗凋亡基因Survivin与结直肠癌关系的研究进展
Survivin基因作为目前所发现的强的凋亡抑制基因,是当前研究的热点.本文首先介绍了Survivin的基因结构,对其生物学作用进行了研究;然后分析了Survivin基因与结直肠癌的发生发展之间的关系;终提出Survivin靶向治疗结直肠癌的方法以及Survivin与结直肠癌预后关系.
