三氧化二砷对淋巴瘤T2细胞株SHP-1基因的去甲基化作用
摘要： 背景与目的:去甲基化作用可能是三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对抗造血系统恶性肿瘤的另一种机制.本研究探讨As2O3对淋巴瘤细胞系T2细胞中抑癌基因酪氨酸磷酸酶(SH2-containinphosphatase-1,SHP-1)的去甲基化作用及对T2细胞生长增殖的生物学影响.方法:T2细胞以As2O3或5-氮杂胞苷(5-aza-2'-deoxyoytidine,5-AC)单独处理,或两药联合处理.采用甲基化特异性PCR、荧光定量PCR和Western检测As2O3处理前后SHP-1基因启动子过甲基化及其mRNA和蛋白表达状况、c-kit蛋白表达变化.MTT法检测细胞存活率.流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:As2O3能逆转SHP-1基因启动子甲基化,使T2细胞SHP-1 mRNA和蛋白重新表达,同时c-kit蛋白表达呈下降趋势;As2O3明显抑制T2细胞的增殖,随浓度增加及作用时间延长,其增殖抑制效应增加(P<0.05);2.5μmol/L浓度的As2O3作用T2细胞t,2,3d细胞增殖抑制率(9.8%,20.3%,47.5%)明显低于联合作用组(11.0%,36.7%.61.0%).As2O3可使T2细胞凋亡率增加,且随作用时间延长和浓度增加,凋亡细胞逐渐增多(P<0.05),联合作用组细胞凋亡率(1 d:17.3%;2 d:37.9%;3 d:67.9%)明显高于2.5 μmol/L As2O3单独作用组(6.1%,26.5%,50.9%).结论:As2O3能去除T2细胞中SHP-1基因甲基化,使其重新表达,并可能通过抑制c-kit受体及其信号转导路径的活化而抑制肿瘤细胞增殖,并诱导细胞凋亡.
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肝癌组织中TGF-β1表达与Treg浸润的关系及其临床意义
背景与目的:调节性T细胞(Treg)在肿瘤组织局部浸润增多,而对其来源报道较少.体外研究表明转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)能诱导Treg的产生,而肝癌组织中TGF-β1表达与Treg浸润的关系尚未阐明.本研究旨在检测肝癌组织中TGF-β1表达,并分析其与Treg浸润的关系,探讨TGF-β1表达,Treg浸润的临床意义.方法:采用免疫组织化学染色的方法检测102例肝癌组织、癌旁肝组织中TGF-β1和Foxp3表达(Foxp3+).结果:肝癌组织中TGF-β1低表达组4l例,高表达组6l例,高表达阳性率为59.8%;癌旁组织中TGF-β1低表达组22例,高表达组80例,高表达阳性率为78.4%,癌组织和癌旁高表达率差异有统计学意义(P=0.001).肝癌组织中Foxp3+细胞平均密度为2.98个／HP,癌旁极少见或未见.肝癌组织中TGF-β1与Foxp3表达呈正相关(r=0.228,P=0.021).肝癌组织中TGF-β1表达在术前血浆AFP浓度高水平组高于低水平组(P=0.023),而与肿瘤直径、肿瘤包膜、肝硬化等临床病理资料无关;肝癌组织中Foxp3表达与肿瘤直径、肿瘤包膜、肝硬化等临床病理资料无关.肝癌组织中TGF-β1表达高低水平组患者5年生存率差异无统计学意义(P=0.790);肝癌组织中Treg高水平组患者的5年生存率低于低水平组(25%vs.44%,P<0.005).多因素cox回归模型分析显示Foxp3+细胞数量、肿瘤包膜是影响肝癌患者预后的独立危险因素(P值分别为0.021、0.001).结论:肝癌组织中Treg浸润可能与TGF-β1表达有关,两者的关系需进一步研究;肝癌组织中Treg数量可作为预测患者术后预后的免疫学指标.
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雷公藤红素对U937细胞Notch 1、NF-κB信号蛋白通路的调控作用
背景与目的:白血病是高度依赖NF-κB的恶性肿瘤,NF-κB与肿瘤的发生和转移以及肿瘤细胞的增殖、凋亡、耐药相关,现已证实NF-κB家族是Notch信号通路的一个靶基因.本研究探讨雷公藤红素对白血病U937细胞凋亡和细胞中Notch 1、NF-κB表达水平的影响.方法:以不同浓度雷公藤红素(0.25～16.0 μmol/L)分别作用于U937细胞12～60 h,MTT法检测细胞增殖活性,透射电子显微镜、流式细胞术观察雷公藤红素对U937细胞凋亡的影响,western blot、RT-PCR法分别检测雷公藤红素对U937细胞内Notch 1通路蛋白、基因表达水平的调控作用,激光共聚焦显微技术检测细胞凋亡时NF-κB的核浆分布变化.结果:雷公藤红素能明显抑制U937细胞增殖,具有浓度依赖和时间依赖性.此外,雷公藤红素以浓度依赖性方式诱导U937细胞凋亡,并伴随明显的凋亡细胞形态学改变,而雷公藤红素的凋亡诱导效应可能与其将细胞阻滞于G0/G1期有关.雷公藤红素对Notch 1通路蛋白及基因表达水平均有不同程度的抑制作用,该抑制作用呈明显的量效关系.NF-κB在胞核表达减少,胞浆表达增多.与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05).结论:雷公藤红素明显抑制U937细胞的增殖,并诱导其凋亡,其抗白血病效应可能与下调Notch 1信号通路以及NF-κB蛋白表达有关.
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维甲酸联合曲古抑素对甲状腺癌细胞的诱导分化作用
背景与目的:维甲酸诱导甲状腺癌分化的有效率约30%,但其毒副作用限制了临床应用.两种以上诱导剂联合应用于肿瘤的分化,临床已开展了Ⅰ～Ⅲ期试验.但对维甲酸和组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂的联合应用,未有报道.本试验初步研究全反式维甲酸(retinoic acid,RA)联合曲古抑素(trichostain A,TSA)诱导人乳头状甲状腺癌细胞株(K1)和人滤泡状甲状腺癌细胞株(FTC-133)的分化,增强诱导作用的效果,同时降低单一药物的毒副作用,为临床前期试验提供理论依据.方法:RA联合TSA,分为4种浓度,分别为1组RA1×10-4mol/L+TSA 1.65×10-7mol/L、2组RA1×10-4mol/L+TSA 3.31×10-7mol/L、3组RA1×10-5mol/L+TSA 1.65 ×10-7mol/L、4组RA 1×10-5mol/L+TSA 3.31×10-7mol/L,在3个时间点(12、24、48 h)处理两种细胞后.采用苏木精-伊红染色后,观察细胞生长的数量、形态;采用氮蓝四唑盐法(methythiazolyltetrazolium,MTT)计算细胞生存率(survival rate,SR),研究联合药物对细胞的增殖、抑制和毒性作用;采用电化学发光法测定两种细胞株培养液中,甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)的水平,研究联合药物对肿瘤细胞的诱导分化作用.结果:联合药物作用K1和FFC-133后,细胞形态趋于规则,细胞间隔增大,细胞核明显缩小.4种浓度、3个时间点SR的方差分析,K1的F值分别为:23.52、170.14,FTC-133的F值分别为:57.09、224.35(P=0.000,均<0.01),有统计学意义.SNK分析,SR由低到高的排列分别为:2组<1组<4组<3组.4种浓度、3个时间点Tg方差分析,K1的F值分别为:69.63、101.07,FTC-133的F值分别为:79.77、81.72(P=0.000,均<0.01),差异有统计学意义.LSD两两比较:K1和FTC-133的1组与3组比较,P分别为:0.06、0.2,>0.05,两者之间差异无统计学意义,其他组均有统计学意义.结论:低浓度RA联合低浓度TSA,既可以抑制K1和FFC-133增殖,降低药物毒性作用.又可以增强对肿瘤细胞的诱导分化.其可能的机制是,TSA作用于转录步骤的DNA前调节,RA可能作用于转录步骤的信号后续调节,两种作用可能形成增强作用.通过转录后的传导系统,达到了抑制肿瘤细胞增殖和增强诱导分化的作用.
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Elf-1和survivin在非小细胞肺癌组织中的表达及其与肿瘤微血管生成的相关性研究
背景与目的:非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中转录因子Elf-1与凋亡抑制因子survivin的表达均与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)有关,且二者均是和细胞周期有关的因子.因此本研究检测NSCLC组织中Elf-1、survivin和CD105标记的瘤内微血管密度(Intra-tumor microvessel density,IMVD)的表达,探讨三者在NSCLC中表达的意义及关系.方法:采用免疫组化PowerVisionTM-9000法检测60例NSCLC组织的组织芯片及9例正常肺组织中Elf-1、survivin和IMVD的表达水平;Western blot检测17例NSCLC组织及5例正常肺组织中Elf-1、survivin的蛋白表达.结果:在正常肺组织中各见1例有Elf-1和survivin弱阳性表达,余为阴性,在NSCLC组织中表达的阳性率分别为70.0%和65.0%,其表达水平与肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移、临床分期和术后生存期有关(全部P<0.05).Kaplan-Meier生存分析表明二者的过表达均与患者的生存率有关,阳性表达的患者生存率明显低于阴性者(P<0.01).Kendell相关分析显示,在NSCLC组织中,二者的表达呈正相关(r=0.769,P<0.01);Spearman相关分析表明,CD105标记的IMVD与Elf-1、survivin的表达均呈正相关(r=0.446,P<0.01;r=0.435,P<0.01).结论:Elf-1、survivin在NSCLC组织中的过表达与肿瘤细胞的分化程度、转移和预后均有关,联合检测其表达水平可作为判定NSCLC恶性生物学行为的参考指标;二者的表达均与IMVD有关,阻断其作用或可成为抗肿瘤血管生成的新途径.
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利用18F-FDG PET-CT显像监测裸鼠鼻咽癌移植瘤早期放疗疗效的研究
背景与目的:早期监测和判断鼻咽癌放疗疗效,并提供个体化治疗是提高鼻咽癌患者生存率的重要因素之一.本研究拟探讨18F-FDG PET-CT显像在裸鼠鼻咽癌移植瘤早期放疗疗效评价中的价值,为进一步临床研究提供依据.方法:所有10只裸鼠鼻咽癌移植瘤动物模型于放疗前均先行18F-FDG PET-CT显像,并于分组前对其中7只裸鼠分别行早期和3 h延迟PET-CT显像.而后将10只裸鼠鼻咽癌移植瘤动物模型随机分成对照组和放疗组.对照组的5只动物在显像完毕后即刻处死并取瘤体标本行病理学检查;放疗组的5只动物在接受12 Gy放疗后的第2天、第4天、第6天再次行18F-FDG PET-CT显像,显像结束后即刻取瘤体标本行病理学检查.应用ROI技术测定瘤体T/NT比值和放疗前、后的瘤体积.结果:早期显像和延迟显像T/NT比值分别为1.806±0.532、1.777±0.597,两者之间差异无统计学意义(P>0.05).放疗组在放疗前与放疗后第2天、第4天、第6天的T/NT比值分别为1.735±0.466、1.818±0.396、1.096±0.101和0.604±0.108;瘤体积分别为(1.48±0.27)cm3、(1.57±0.31)cm3、(1.59±0.31)cm3和(1.60±0.29)cm3.放疗后第6天与其他时间点瘤体T/NT比值差异有统计学意义(P<0.05),且放疗6天后瘤体死亡细胞比例为(93.00±7.42)%.结论:18F-FDG PET-CT显像在裸鼠鼻咽癌移植瘤早期放疗疗效评价中具有重要价值.且放疗后第6天可能是合适的时间选择点.放疗前18F-FDG PET-CT延迟显像的T/NT比值测定对鼻咽癌诊断可能没有意义.
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Akt通路在热化疗联合诱导人小细胞肺癌细胞凋亡中的作用
背景与目的:Akt通路是细胞内一条重要的信号通路,与细胞生长、凋亡密切相关,本研究旨在探讨Akt通路在热化疗诱导人小细胞肺癌细胞凋亡中的作用,进而探讨热疗抑制肺部肿瘤细胞增殖可能的机制.方法:参考临床常用剂量,采用43℃加热联合120μg/L紫杉醇(热化联合组)、43℃加热联合120μg/L紫杉醇并加入1 μmol/L Akt特异抑制剂Wortmannin(Wortmannin组)、43%加热联合120μg/L紫杉醇并加入30 μmol/L活性氧(reactive oxygen species,ROS)特异抑制剂NAC(NAC组)、单纯使用120μg/L紫杉醇(单纯化疗组)处理H446细胞,以未处理的H446细胞作为对照组,应用噻唑蓝比色法(MTT法)检测各处理方式下细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,荧光法检测细胞内ROS,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Akt磷酸化水平和caspase-3的表达,采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析.结果:热化联合组细胞增殖率(59.83±3.36)%低于对照组(100.00±0.00)%和单纯化疗组(69.16±2.95)%(P<0.05);热化联合组的细胞凋亡率高(27.59±5.47)%(P<0.05);热化联合组的ROS表达增高(102.14±18.34)(P<0.05),NAC可抑制其表达(28.01±1.19),Wortmannin对其无影响(99.87±8.35);Akt磷酸化水平在热化联合组降低(0.69±0.03)(P<0.05),Wortmannin可抑制其磷酸化(0.00±0.00),NAC使其磷酸化水平升高(1.05±0.29)(P<0.05);热化联合组的caspase-3表达(1.07±0.08)高于其他各组(P<0.05).结论:热化疗联合应用可以明显抑制H446细胞的生长,这种抑制作用可能是通过诱导ROS的产生,继而抑制Akt通路活化,并通过caspase途径导致细胞凋亡.
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塞来昔布对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡和Survivin表达的影响
背景与目的:选择性COX-2抑制剂塞来昔布是近年来开发的新型非甾体类抗炎药.大量实验证明塞来昔布具有明显的抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用,这在结直肠肿瘤和家族性腺瘤性息肉病中已经得到了证实.本研究观察塞来昔布在体外对人胶质瘤细胞株U251的抑制增殖和诱导凋亡的作用,并探讨该作用与Survivin表达之间的关系.方法:用不同浓度塞来昔布溶液处理对数生长期的U251细胞,在倒置显微镜下动态观察瘤细胞的生长情况.用MIT比色法检测不同时间点各药物浓度组细胞增殖情况.不同浓度塞来昔布处理U251细胞48 h后,用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率,免疫细胞化学法及Western blot法榆测各组细胞中Survivin蛋白的表达情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量法检测各组细胞中survivin mRNA的表达水平.结果:塞来昔布处理后细胞出现明显凋亡样形态学改变.10～100 μmol/L塞来昔布对U251细胞增殖均有抑制作用,该作用随着药物浓度的增加和作用时间的延长而增强.塞来昔布处理U251细胞48 h后,流式细胞检测结果显示出明显的细胞凋亡,凋亡率随着塞来昔布浓度的增高而升高;免疫细胞化学结果显示,对照组细胞中Survivin蛋白高表达,实验组中随着塞来昔布浓度的增加阳性细胞数目逐渐减少、染色逐渐减淡、蛋白表达的灰度值亦随之上升;Western blot结果显示随着药物浓度的增高,Survivin蛋白表达量逐渐降低;半定量RT-PCR检测结果显示,塞来昔布作用后U251细胞中survivin mRNA表达明显降低,各实验组与对照组之间的差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:塞来昔布可明显抑制胶质瘤U251细胞增殖并促使瘤细胞凋亡,这些作用呈时间和剂量依赖性.塞来昔布抗肿瘤的作用机制可能与下调survivin的表达有关.
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EBV相关胃癌中Fas/FasL的表达及其与凋亡的关系
背景与目的:大约有10%的胃癌组织EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV阳性,但EBV在胃癌发生发展中的作用尚不明确.本研究检测Fas、FasL在EBV相关胃癌(EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC)中的表达,及其与肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)凋亡的相互关系.方法:采用免疫组织化学方法检测49例EBVaGC、20例EBV阴性胃癌(EBVnegative gastric carcinoma,EBVnGC)以及12例正常胃黏膜中Fas、FasL的表达,并采用TUNEL技术检测细胞凋亡指数(apoptosis index,AI).结果:12例正常胃黏膜和69例胃癌组织的Fas阳性率分别为91.7%和76.8%,FasL阳性率分别为16.7%和58.0%,差异有统计学意义(P＜0.05);Fas在EBVaGC和EBVnGC组织中的阳性率分别为71.4%和90.0%,差异无统计学意义(P＞0.05).FasL在EBVaGC和EBVnGC组织中的阳性率分别为63.2%和45.0%,差异有统计学意义(P＜0.05),且在弥漫型中的表达高于肠型(P:0.015);EBVaGC肿瘤细胞AI显著低于EBVnGC(P=0.002);TIL在EBVaGC的数量和AI均较EBVnGC高(P＜0.05),且TIL的AI值与肿瘤细胞FasL表达呈正相关(r=0.237,P=0.028).结论:EBVaGC中FasL蛋白表达的上调及TIL凋亡的降低有利于肿瘤细胞逃避机体免疫监视,为肿瘤的发生发展创造条件.
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水杨醛氨基酸Schiff碱铜三元配合物对人胃癌细胞株BGC823增殖的作用及机制
背景与目的:水杨醛氨基酸Schiff碱基本结构中含C=N键,当其与金属离子配位后生物活性增强,表现出一定的抗癌、抑菌等活性.本研究主要探讨4种水杨醛氨基酸Schiff碱铜配合物(6B、7B、6P、7P)对人胃癌细胞株BGC823增殖的影响,并初步探讨其作用机制.方法:取对数生长期的BGC823细胞传代培养,24 h后加药,MTT法测定4种配合物对BDC823细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化;DNA ladder试验检测DNA损伤;免疫细胞化学法检测P53蛋白表达水平.结果:MTT实验结果:不同种类的水杨醛氨基酸Schiff碱铜配合物对BGC823细胞的生长均有明显的抑制作用,并且随配合物浓度的增大抑制作用有增强的趋势.4种配合物对BGC823细胞的IC_(50)分别为6B 18.10 μmol/L,7B 27.50 μmol/L,6P 3.61 μmol/L,7P 3.45 μmol/L.流式细胞仪检测表明4种铜配合物均可明显提高BGC823细胞凋亡率,DNA ladder试验也证实这一点;流式细胞仪检测还揭示铜配合物引起S期细胞和G_2期比率增加,G_1期细胞减少;P153蛋白免疫细胞化学染色显示,4种配合物均能够下调BGC823细胞突变型P53蛋白的表达,提示细胞凋亡的发生与p53依赖的凋亡通路有关.结论:配合物6B、7B、6P、7P在体外均能明显抑制肿瘤细胞BGC823生长增殖,诱导细胞凋亡,并造成细胞周期分布的改变.其机制可能与p53依赖的凋亡通路有关.
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肿瘤耐药相关蛋白及β-catenin在食管鳞状细胞癌中的表达及意义
背景与目的:随着化疗药物在肿瘤临床治疗中的广泛应用,肿瘤对化疗药物产生多药耐药性的问题越来越突出,已成为肿瘤联合化疗失败的主要原因之一.本研究检测β-catenin以及肿瘤耐药相关蛋白MRP2、P-gp、Bcl-2在食管鳞状细胞癌(esophageal squamoua cell carcinoma,ESCC)中的表达,探讨它们在ESCC的多药耐药发生发展中的作用和相互关系.方法:运用组织芯片技术、免疫组织化学方法以及图像分析技术检测582例ESCC及其癌旁294例正常黏膜、92例单纯细胞增生和87例不典型增生上皮组成的组织芯片中MRP2、P-gP、β-catenin及Bcl-2的表达情况,并分析其与各临床病理参数之间的关系.结果:MRP2、Bcl-2在ESCC中的累积光密度(integral optical density,IOD)值[分别为(195.7±175.9)×103和(90.5±112.5)×10~3]显著高于其在癌旁正常组织中的IOD值[分别为(104.8±86.1)×10~3和(25.2±46.6)×10~3],差异有统计学意义(P＜0.01);Pgp、β-catenin在ESCC中的IOD值[分别为(57.7±75.5)×10~3和(32.0±47.0)×10~3]显著低于其在癌旁正常组织中的IOD值[分别为(114.8±106.6)×10~3和(46.1±35.7)×10~3],差异有统计学意义(P＜0.01);随着ESCC的分化程度按高分化-中分化-低分化顺序依次改变,MRP2的IOD值依次递增,β-catenin在低分化ESCC中的IOD值大于其在中、高分化ESCC中的IOD值,Bcl-2在高分化ESCC中的IOD值低于其在中、低分化ESCC中的IOD值,差异有统计学意义(P＜0.01);β-catenin、Bcl-2在ESCC浸润至黏膜层的病例的癌组织标本中的IOD值大于其在ESCC浸润至肌层或浆膜层的病例的癌组织标本中的IOD值,差异有统计学意义(P＜0.01);有淋巴结转移的Bcl-2的IOD值显著高于无淋巴结转移(P＜0.01);ESCC中P-gp的表达分别与MRP2、Bcl-2的表达呈明显正相关(r=0.288和r=0.253,P＜0.01).结论:P-gp与MRP2及Bcl-2可作为ESCC多药耐药的预测因子.β-catenin可能在ESCC的发生发展中起着重要作用.
