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肝细胞涂片在评估图像分析仪的精确性和准确性中的应用
多年的肿瘤病理和肿瘤临床研究已经证明,细胞核DNA倍体的异常变化对恶性肿瘤的诊断、疗效估价、预后评估具有重要的指导意义[1-3].图像分析仪已广泛应用于测量和分析肿瘤细胞核DNA倍体[3].目前,我国图像分析仪的生产厂家众多,但至今没有一个统一的国家或学会的技术标准,不可避免地导致国产图像分析仪在质量和性能上存在差异.而使用时缺乏一种简单而有效的方法去检测和评估图像分析仪测量细胞核DNA含量的精确性和准确性.我们对此进行了探讨.
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乳腺癌神经内分泌分化的DNA倍体研究
我们采用自行设计的MIPS-Ⅲ型图像分析仪对17例神经内分泌（NE）细胞阳性的乳腺癌和64例NE阴性的乳腺癌癌细胞核DNA含量、核面积等9项参数进行测量，以探讨伴神经内分泌细胞分化的乳腺癌的恶性程度、生物学行为。 一、材料与方法 1.材料：81例标本取自1989～1994年浙江大学医学院附属第一医院外科切除标本。组织切片经2位病理医师分别按1990年WHO和1989年《中国恶性肿瘤诊治规范》乳腺癌标准进行组织学分型和分级：浸润导管癌53例，导管内癌5例，浸润性小叶癌6例，粘液样癌6例，髓样癌7例，其他类型癌4例，病理分级Ⅰ级10例，Ⅱ级33例，Ⅲ级38例。
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睾丸生精细胞涂片:在评估图像分析仪光度测量线性中的应用
目的 评估TIGER细胞图像分析仪测量细胞图像光度的线性.方法 选取十只健康成年小白鼠的睾丸组织,制成细胞悬液,涂片,快速Feulgen染色,TIGER细胞图像分析仪测量涂片内三种单个完整生精细胞核的DNA含量并比较它们的比值关系,分析其平均吸光度(AOD)的大、小值范围.结果 三种生精细胞核的DNA含量呈1、2、4的比例,其AOD值范围为0.73～1.64.结论 TIGER细胞图像分析仪在其平均吸光度值为0.73～1.64的范围内测得的组织、细胞图像光度呈线性.
关键词： 生精细胞 DNA倍体 Feulgen染色法 图像分析仪 -
组织切片对细胞核DNA含量检测的影响
目的 探讨组织切片对图像分析仪测量细胞核DNA含量的影响.方法 选取10只成年健康雄性小鼠,制备肝细胞涂片和肝组织切片,肝组织切片分成两部分,分别用于Feulgen染色和石蜡包埋.包埋后的组织采用垂直切片,图像分析仪测量切片实际厚度,依据切片机标识厚度和测量厚度分别分组,TIGER细胞图像分析仪分剐测量肝细胞涂片和组织切片内肝细胞核的积分光密度(IOD).结果 肝细胞涂片内各DNA含量倍体肝细胞核IOD间的比值接近2和4,IOD之变异系数(CV值)<3.5,肝组织切片IOD间比值明显偏离2和4,IOD之CV值均>6;切片机标识厚度为4、6、8和10μm组织切片平均测量厚度分别为6.75、7.18、6.96和7.59 μm,测量厚度大值为9.25μm,小值为4.62μm;依据切片机标识厚度分组中不同切片厚度相同DNA含量倍体肝细胞核的IOD值差异均无统计学意义;依据测量厚度重新分组后5、6微米组与7、8、9微米组IOD值间的差异具有统计学意义(P<0.05).结论 组织切片的实际厚度与切片机标识厚度间存在明显差异,本实验方法可较准确地判断组织切片厚度;厚组织切片测量结果优于薄组织切片,但与细胞涂片相比,厚组织切片仍难以准确测量细胞核DNA含量,DNA含量检测时应优先采用细胞涂片.
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滤光片对细胞核DNA含量检测的影响
目的 探讨滤光片对图像分析仪测量DNA含量的影响.方法 选取10只成年健康雄性小鼠,制备肝细胞涂片,Feulgen染色和天青B染色,显微镜与摄像机之间分别插入400 nm、560 nm、590 nm、600 nm、626 nm、670 nm带通滤光片和中灰滤光片,利用TIGER细胞图像分析仪测量肝细胞核的积分光密度(IOD)与平均光密度(AOD)和面积.结果 肝细胞核在Feulgen染色法中呈紫红色,天青B染色法呈蓝色.Feulgen染色和天青B染色分别采用560 nm和600 nm的带通滤光片时,能够测得大的IOD值,不同倍体肝细胞核间的比值接近2、4,CV值低.与天青B染色方法相比,Feulgen染色法中不同倍体间的比值更接近2、4,CV值更低.结论 适宜的滤光片可提高细胞核DNA含量测量结果的精确性和准确性.Feulgen染色测量结果精确性和准确性明显高于天青B染色,应作为首选的染色方法.
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光衍射现象对细胞核DNA含量检测的影响
利用图像分析仪测量小鼠肝细胞涂片内单个肝细胞核的DNA含量,探讨图像分析仪在测量显微图像的光度时光衍射现象所导致的测量误差.本文选取10只成年健康雄性小鼠的肝组织涂片,Feulgen染色,TIGER细胞图像分析仪测量单个肝细胞核的DNA含量并分析其DNA含量倍体;结果显示,(1)涂片内肝细胞核分布均匀,轮廓清晰,呈紫红色;(2)不同小鼠同一DNA含量倍体的肝细胞核的DNA含量大致相同;(3)二、四、八倍体肝细胞核的DNA含量比值均大于/[Dept.1]等于2或4,二、四、八倍体肝细胞单个核DNA含量的CV值均小于10%;(4)同一小鼠不同DNA含量倍体肝细胞核的平均光密度值差异较小.结论:光衍射现象可导致DNA含量的测量结果偏低,其偏低的程度随待测细胞核的面积增加而减小.
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染色质浓缩对细胞核DNA含量检测的影响
目的 利用三种不同方法制备小鼠肝细胞涂片,探讨染色质浓缩对图像分析仪测量DNA含量的影响.方法 本文选取10只成年健康雄性小鼠,采用传统涂片、液基制片法和甲醛固定后液基制片法制备小鼠肝细胞涂片,Feulgen染色,TIGER细胞图像分析仪分别测量三种涂片内肝细胞核的积分光密度、平均光密度和面积.结果 三种涂片内肝细胞核分布均匀,轮廓清晰,呈紫红色,与传统涂片法相比,液基法内肝细胞核面积明显减小,染色质高度浓缩;相同倍体的肝细胞核在传统涂片中面积大,平均光密度低,各倍体间的比值接近2和4,积分光密度CV值低(＜3.5).固定法和液基法平均光密度明显升高,各倍体间比值明显偏离2和4,积分光密度CV值＞6.结论 不同制片方法可导致同一类型、处于相同功能状态的细胞核染色质浓缩程度产生明显差异,染色质浓缩可导致平均光密度值升高,积分光密度值降低,测量结果的精确性和准确性降低.
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图像分析仪在形态计量学研究中的使用体会
介绍了图像分析仪在形态计量学研究过程中有关定标、测量的一些体会,提出了灰度测量时应注意的事项,灰度和光密度的区别以及误差问题.
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显微图像分析仪在医学形态学教学中的应用--介绍一种局域网的多媒体互动教学系统
本文介绍了医学形态学教学中应用的四种显微教学系统:通过模拟摄像机将视频信号直接在电视机上显示简单的"彩色电视显微教学系统";由显微图像分析仪加投影机组成的教学系统;和由显微图像分析仪对所有学生显微镜图像进行采集显示的单向互动显微教学系统以及由学生端和教师端都采用显微图像分析仪组成"双向互动的网络显微教学系统".作者认为"双向互动网络显微教学系统",相对前三种系统而言,能有效地进行互动教学和方便各种多媒体课件的使用,具有开放性和可扩展性,将可能替代以往的模拟中控方式的教学系统,成为医学形态学教学系统的发展方向.
关键词： 显微 图像分析仪 医学形态学 计算机辅助教学(CAI) -
石蜡包埋组织自动和手动切片对切片厚度的影响
目的 观察手动与自动两种切片方法和组织种类对实测切片厚度的影响.方法 选取5只成年健康雄性SD大鼠的肝、胰腺、胃及肺4种组织,各组织单独包埋制成蜡块.预设电动切片机的切片厚度刻度值为3、5、7、10 μm,分别作自动和手动两种方法切片,所获得的薄组织片经二次包埋、切片、HE染色,TIGER图像分析仪测量切片的实际厚度.结果 组织切片实测厚度受自动和手动两种切片方法的影响,切片机的切片厚度预设值低估了石蜡包埋组织切片的真实厚度,自动和手动实测切片厚度分别比切片机预设切片厚度要厚29%～50%和48%～91%.结论 自动切片与手动切片的切片厚度相差25%,二者相对误差为61%,自动切片获得的组织切片的厚度精度较高,优于手动切片.
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抗纤复方Ⅰ号抗酒精性肝病的实验研究
目的:利用酒精性肝病的大鼠模型,研究抗纤复方Ⅰ号(KXI)对酒精性肝病的预防作用及其机制.方法:采用乙醇灌胃法制备酒精性肝病大鼠模型.Wistar大鼠随机分为3组,正常组,酒精组及中药组.中药组在造模同时,给予抗纤复方I号水煎剂(生药浓度4.5 kg/L)4 mL/kg-1,2次/d灌胃,观察12 wk.实验4 wk、8 wk、12 wk末分批处死动物,HE及VG染色观察各组大鼠肝细胞变性及纤维组织增生情况,应用病理图像分析仪对纤维组织增生进行半定量分析.电镜下观察肝星形细胞形态改变.应用TBA比色法测定各组大鼠肝组织中丙二醛(MDA)含量,羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)含量.结果:HE染色酒精组4 wk末即出现肝细胞坏死,脂肪变,炎性细胞浸润.12 wk末脂肪变及肝细胞坏死增多,中药组8 wk时才出现轻度脂肪变,肝细胞坏死及炎性细胞浸润均不明显.VG染色酒精组可见纤维组织增生,呈条索状向肝小叶内延伸,中药组无纤维条索形成.图像分析仪所示胶原面积百分比酒精组明显高于正常组及中药组(19.24±2.5 vs 4.6±0.7,19.24±2.5 vs9±0.9,P＜0.05).电镜下观察酒精组肝细胞失去正常结构,星形细胞增多、变形,细胞外可见较多胶原原纤维.中药组肝细胞及星形细胞形态基本正常,基质内亦可见少量胶原原纤维.酒精组MDA在实验4 wk末即已升高,与正常组及中药组比较差异显著(32±3 vs16±7,32±3 vs 23±8,P＜0.05),且随酒精摄入量的增加而进行性升高(32±3→36±4→62±2,P＜0.05).组织中SOD活性在实验4 wk末,无论酒精组还是中药组均有升高,但随着实验进程,酒精组SOD活性进行性下降(118±5→92±10→71±9,P＜0.05),而中药组仍维持较高水平(8 wk,12 wk分别为159±20,129±7)与酒精组比较差异显著(159±20vs92±10,P＜0.05).结论:抗纤复方Ⅰ号具有良好的抗大鼠酒精性肝病的作用,其作用机制与抑制脂质过氧化反应及HSC活化有关.
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营养支持途径对严重烧伤早期肠黏膜修复的影响
目的:探讨营养支持途径对严重烧伤早期肠黏膜修复的影响.方法:将30%TBSAⅢ度烧伤大鼠行颈外静脉插管后,随机分为肠道喂养(EF)组及静脉营养(PN)组,分别采用灌喂和颈外静脉输入方法给予等氮、等热卡的营养液.动态观察空肠与回肠黏膜组织形态学的变化,用图像分析仪测量肠黏膜厚度、绒毛高度,并计算绒毛表面积.结果:烧伤后早期PN组与EF组的空肠与回肠黏膜组织结构均受到明显损害.EF组伤后6,12,24,48 h空肠和回肠黏膜厚度分别为341±33 μm、404±30μm、418±42μμm、418±57 μm及313±34μm、306±81 μm、302±55μm、268±21 μm,绒毛高度分别为253±33 μm、287±23 μm、285±42 μm、260±40 μm及175±30μm、210±57μm、190±31 μm、163±1 7 μm,绒毛表面积分别为0.045±0.011 mm2、0.056±0.011 mm2、0.071±0.007mm2、0.054±0.006mm2及0.030±0.006mm2、0.045±0.019mm2、0.036±0.011 mm2、0.028±0.004mm2,均与PN组无明显差别(P＞0.05).但至伤后72 h,EF组空肠和回肠黏膜厚度、绒毛高度及绒毛表面积分别为397±34μm、253±41 μm、0.051±0.009 mm2及275±38 μm、180±31 μm、0.030±0.006 mm2,而PN组空肠和回肠黏膜厚度、绒毛高度及绒毛表面积分别为227±25 μm、146±14 μm、0.024±0.0062 mm2及206±15μm、125±16 μm、0.01 7±0.0042 mm2,EF组非常明显地高于PN组(P＜0.01).结论:肠道喂养较静脉营养能更好地维护严重烧伤后早期肠黏膜组织结构,促进受损肠黏膜的修复.
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慢性胃炎与胃癌胃黏膜超微结构及其分子生物学的比较研究
目的:慢性胃炎与胃癌胃黏膜超微结构及其分子生物学的比较研究.方法:对168例慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和胃癌患者胃黏膜,采用组织化学染色、扫描电镜附能谱仪、透射电镜附能谱仪、图像分析仪、放射免疫法和化学发光法等现代科学技术手段,同步检测胃黏膜和胃黏膜上皮细胞超微结构、微量元素、DNA、cAMP和SOD,以及3H-TdR LCT、LPO.结果:上皮细胞核质比＞1的发生率、核分叶的发生率、染色质间颗粒密集的发生率、核仁肥大的发生率、细胞核DNA、Zn、Cu和血清LPO,健康对照组组为0.0,0.0,6.7,0.0,12.6±2.7,7.6±0.4,58.4±0.3,2.6±0.6,CSG组为5.7,2.9,7.4,2.9,15.2±3.1,8.1±0.5,58.9±0.5,4.2±0.7,CAG组为31.3,29.7,45.3,42.2,16.5±3.1,8.6±0.4,59.3±0.5,4.5±0.6,CA组为100.0,100.0,72.2,50.0,30.7±8.2,8.8±0.3,59.5±0.4,6.8±1.6;而线粒体Zn、Cu,胃黏膜cAMP和SOD、3H-TdR LCT,健康对照组组为9.2±0.5,58.3±0.3,15.9±1.5,170.5±6.1,1079.7±227.4,CSG组为8.6±0.5,57.8±0.3,14.6±1.8,163.3±5.6,867.3±240.5,CAG组为8.3±0.4,57.5±0.3,13.4±1.8,161.2±4.3,800.9±221.8,CA组为8.9±0.4,57.1±0.3,10.2±3.9,152.2±3.8,325.7±186.8,组间有显著性差异,P＜0.05～0.01.结论:慢性胃炎与胃癌间在胃黏膜超微结构及其分子生物学上还是有显著性差异的;慢性萎缩性胃炎必须在机体内环境改变的基础上,结合外环境不良因素的刺激,才有可能发展成胃癌.
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胃黏膜超微结构、DNA、Zn、Cu和LP0研究慢性胃炎分类
目的:探索慢性胃炎中无症CSG、无症CAG、有症F型、有症CSG和有症CAG的病理生理学渊由.方法:对188例患者,应用透射电镜、能谱仪、图像分析仪与化学发光法等现代科学技术手段,同步检测胃黏膜上皮细胞超微结构、微量元素、DNA和SOD,以及LPO.结果:胃黏膜上皮细胞核Zn、Cu、DNA和血清LPO含量,健康对照组(7.6±0.4,58.4±0.3,12.6±2.7,2.6±0.6),无症CSG组(7.8±0.3,58.6±0.4,13.0±3.1,2.9±0.4),无症CAG组(7.8±0.3,58.7±0.3,14.3±2.8,3.1±0.4),有症F型组(7.9±0.4,58.7±0.5,13.5±4.6,2.9±0.7),有症CSG组(8.1±0.5,58.9±0.5,15.2±3.2,4.2±0.7),有症CAG组(8.6±0.4,59.3±0.5,16.5±3.1,4.5±0.6);而线粒体Zn、Cu和胃黏膜SOD含量,健康对照组(9.2±0.5,58.3±0.3,170.5±6.1),无症CSC组(8.9±0.5,58.2±0.3,167.2±5.3),无症CAG组(8.8±0.4,57.5±0.2,166.1±4.2),有症F型组(8.9±0.5,58.0±0.3,167.9±5.7),有症CSG组(8.6±0.5,57.8±0.3,163.3±5.6),有症CAG组(8.3±0.4,57.5±0.3,161.2±4.3),组间均有显著性差异,P＜0.05～0.001.胃黏膜上皮细胞超微结构与此发生同步变化.结论:有病有症、有病无症、无病有症都发生在胃黏膜上皮细胞超微结构及其相关的生物活性物质的质量变化的基础上.
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益心舒胶囊对阿霉素致心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响
目的：研究益心舒胶囊对阿霉素（ADR）致心力衰竭（HF）大鼠心肌细胞凋亡的影响。
方法：48只雄性大鼠随机分为正常组、模型组、益心舒组、厄贝沙坦组，每组12只。将注射用ADR用生理盐水配成2 mg/ml溶液，在模型组，益心舒组和厄贝沙坦组均腹腔注射ADR2.5 mg/kg，每周一次，持续六周，复制大鼠HF模型；另12只正常组大鼠腹腔注射等量的生理盐水，6周时造模各组随机选取其中1只做病理检测及2只做超声心动以确定模型是否成功。从造模第5周开始益心舒组、厄贝沙坦组分别按人与大鼠体表面积折算为大鼠灌胃剂量，相当于临床成人的正常剂量，为320 mg/kg/d、50 mg/kg/d，正常组和模型组大鼠予以与益心舒组等量生理盐水，每天上午灌胃一次，连续给药28天。将待检心肌标本用10％中性缓冲甲醛液固定18 h后脱水、浸蜡、石蜡包埋。连续切片4μm厚，经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色，光镜下（10×20）进行病理学观察。用原位末端转移酶标记技术法检测大鼠心肌细胞凋亡，计算凋亡率；免疫组化方法结合图像分析半定量测定检测心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达，采用CMIAS-Ⅱ图像分析仪分析各视野的平均光密度值，计算均值作为此组的代表值。采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析法，两两比较采用LSD检验法，以P<0.05表示差异有统计学意义。 -
心复力颗粒对阿霉素致扩张型心肌病心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响
目的：探讨心复力颗粒对阿霉素（ADR）致扩张型心肌病（DCM）心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。
方法：72只SD大鼠随机分为正常组，模型组，厄贝沙坦组，心复力颗粒低、中、高剂量组，除正常组外均予ADR腹腔注射制备DCM心衰大鼠模型，正常组注射等量的生理盐水，每周1次，持续6周。从注射ADR第5周各组开始灌胃给药，将心复力颗粒用蒸馏水配成0.5 g/ml的混悬液，心复力颗粒低、中、高剂量组的灌胃剂量分别为0.675 g/（kg·d）、1.350 g/（kg·d）、2.700 g/（kg·d），厄贝沙坦组剂量为50 mg/（kg·d），正常组和模型组给予与中剂量组等量的生理盐水，每天上午灌胃1次，连续给药4周。将待测左室前壁标本用10％中性缓冲甲醛液固定18 h后脱水、浸蜡、石蜡包埋，连续切片4μm厚，经苏木精-伊红染色，光镜下（10×20）进行病理学观察。用原位末端转移酶标记法检测大鼠心肌细胞凋亡：应用CMIAS-Ⅱ图像分析仪在10×40倍视野下，所有大鼠每张切片随机选取5个视野，随机不重复计数100个心肌细胞。用免疫组化法结合图像分析半定量方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达，用CMIAS-Ⅱ图像分析仪分析各视野的平均光密度值。采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析法，两两比较采用LSD检验法，以P<0.05表示差异有统计学意义。 -
测定肿瘤细胞DNA含量和倍体中需斟酌的两个问题
随着图像分析技术的发展与普及,在化学成分定量分析中越来越多地使用图像分析仪.我们在实际应用图像分析仪测定肿瘤细胞DNA含量和倍体时,发现有某些需斟酌的问题,现举其中两个与同道讨论,希望能起到抛砖引玉之效.
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丙烯腈对小鼠睾丸组织形态学的影响
丙烯腈对雄性小鼠生殖系统具有细胞毒作用,我们通过雄性小鼠腹腔注射染毒,光镜结合病理图像分析仪定量测定,探讨丙烯腈染毒后小鼠睾丸组织学形态改变.
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成釉细胞瘤细胞计量病理学的研究
目的用计量病理学方法探讨成釉细胞瘤上皮细胞的增殖特性.方法利用多功能图像分析系统对26例成釉细胞瘤的上皮细胞进行计量形态学和DNA含量分析,并用角化囊肿、根尖囊肿、含牙囊肿各10例进行对比.结果上皮细胞核DNA含量及形态参数比较显示;成釉细胞瘤明显大于含牙囊肿(P＜0.05),与角化囊肿和根尖囊肿相近;滤泡型大于丛状型(P＜0.05);外周细胞明显高于中央细胞(P＜0.05).结论成釉细胞瘤上皮细胞增殖活跃,其增殖特性符合临界性肿瘤的生物学特点.
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MIAS-300图像分析仪在形态计量学研究中的应用
介绍了MIAS(micro image analysis system)图像分析仪的系统构成、测量的主要步骤以及定标操作方法；介绍了目标参数及体视学参数的定义及算法。结果显示，MIAS-300图像分析仪适用于从二维或三维角度进行形态计量学研究。
