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两种非病毒载体介导microRNA转染的对比
microRNA作为核酸类药物,在细胞和生物体内存在稳定性差,半衰期短,转染效率低,靶向性差[1],故转染过程需要高效、高安全性的载体.Lipofectamine是常用的转染脂质体,可与 DNA形成复合物,有较强的转染能力.聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)属阳离子聚合物,在体内外均有较高的转染效率,不良反应较低[2].选择适合的小分子RNA基因载体对其后续研究至关重要.本研究分别选择了脂质体lipofectamin2000和阳离子聚合物PEI作为microRNA的转染载体,在体外检测其在悬浮细胞THP-1中的转染效率和细胞死亡率,比较两种转染载体的转染特性及作为microRNA基因载体的可行性.
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腺相关病毒载体介导造血干细胞基因转导的策略
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)已被广泛用作基因治疗的载体.本文就提高AAV载体在HSCs中的基因转导效率的策略综述如下.
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逆转录病毒载体介导反义K-ras基因治疗胰腺癌的实验研究
目的:分离及克隆胰腺癌细胞基因组中K-ras基因片段,构建含反义K-ras癌基因逆转录病毒载体并探讨其对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响及可能的分子机制.方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI和EcoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3、PC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1、4及侧翼序列,将目的基因克隆入逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒,经PT-67细胞包装后获得重组逆转录病毒.将该重组逆转录病毒转染上述细胞,经G418筛选获得稳定细胞,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增生、凋亡和对胰腺癌p21蛋白表达;建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,观察反义K-ras基因体内治疗效果.结果:成功构建含反义K-ras基因的重组逆转录病毒载体.反义K-ras基因抑制胰腺癌细胞增生,诱导细胞凋亡、下调K-rasmRNA和P21蛋白表达,并抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长.结论:反义K-ras基因可使胰腺癌细胞增生受到抑制,并可诱导细胞凋亡和下调K-rasmRNA和P21蛋白表达.
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应用载体介导的RNAi技术抑制人胃癌和腹膜间皮细胞中TGF-β1的表达
目的:应用载体介导的RNAi技术特异地干扰TGF-β1在人胃癌细胞株SGC-7901和腹膜间皮细胞中的表达.方法:使用线性化的pcPUR βiCassette质粒构建针对TGF-β1基因的siRNA表达载体;hU6载体启动子下游插入含TGF-β1基因特异性序列的62 mer寡核苷酸片段;采用胰蛋白酶-EDTA消化法,从人的腹膜组织中分离腹膜间皮细胞.采用形态学和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法对培养细胞进行鉴定.将TGF-β1-siRNA载体转染人的上述两种细胞,以半定量RT-PCR和Western印迹方法检测转染后两种细胞中TGF-β1的表达水平的变化.结果:电泳、DNA测序证实合成的siRNA基因序列正确并已准确克隆入pcPUR βiCassette载体.免疫组化染色结果显示腹膜间皮细胞角蛋白,波形蛋白表达阳性,而白细胞共同抗原(CD45),第Ⅷ因子相关抗原阴性.与各自未处理组比较,两种细胞TGF-β1-siRNA载体组的mRNA和蛋白均明显下降,并以蛋白下降更为明显.人胃癌细胞株SGC-7901 TGF-β1蛋白下降约65.8%,人腹膜间皮细胞TGF-β1蛋白下降约61.8%.结论:载体介导的RNAi技术可成功地干扰TGF-β1在人胃癌细胞株SGC-7901和腹膜间皮细胞中的表达,为今后胃癌腹膜转移的基因靶向治疗奠定了基础.
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反义人IGF-I基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究
观察和探讨逆转录病毒载体介导的人反义IGF-I基因转移对抑制血管平滑肌细胞增殖的效果.
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病毒载体介导的帕金森病基因治疗研究进展
帕金森病(PD)是一种常见的神经系统变性疾病,其病理改变主要为中脑黑质致密区多巴胺能神经元变性和消失,以及体内多巴胺水平的下降.80年代末,随着基因治疗概念的不断深入,基因治疗技术日趋成熟,人们开始了对PD基因治疗的尝试.近年来PD动物模型基因治疗已经取得了不少进展.在基因治疗的体外及体内两种途径中,研究多的是病毒载体相关的基因导入系统.目前研究较多病毒载体有:腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、其他逆转录病毒载体.
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腺伴随病毒载体介导帕金森病基因治疗的实验研究
一、材料和方法1.腺伴随病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic amino-acid decarboxlase,AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GTP cyclohydrolase I,GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第1内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3天后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.以DNA斑点印迹法测定载体滴度为1 012~1 013颗粒/ml.
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bcl-2部分编码区的反义RNA促进烷化溶血磷脂诱导的白血病细胞凋亡
bcl-2抗凋亡基因在白血病细胞株常有高表达,引起对化放疗的耐受,封闭该基因的转录和翻译都将诱导白血病细胞凋亡,且对化放疗敏感.本研究通过比较逆转录病毒载体介导的全部和部分编码区的bcl-2反义基因瞬时和稳定表达在对抗bcl-2作用、降低内源性bcl-2蛋白水平和对烷化溶血磷脂ET 18-OCH3 (ALP)诱导白血病细胞凋亡的影响的差异,探讨了短片段bcl-2反义RNA作用特点,以期为硫代寡聚脱氧核苷酸的治疗白血病和对ALP协同体外净化白血病细胞提供实验基础.
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重组腺相关病毒载体介导人型血管内皮生长因子基因对缺血心肌血管新生的影响
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纳米载体介导的抗转录激活因子核酶对血管内皮细胞表面主要组织相容性复合物Ⅱ分子的抑制
移植血管病(GVD)仍是心脏移植成功与否的关键因素.尽管GVD的发病机制尚不十分清楚,但Labarrere等[1]证实内皮细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ分子与GVD密切相关.MHCⅡ分子转录激活因子(CⅡTA)是MHCⅡ结构及诱导性表达关键的总调节因子,只在MHCⅡ阳性细胞中出现[2,3].本文以抗CⅡTA的核酶抑制血管内皮细胞系表面MHCⅡ抗原的表达,为心脏移植排斥问题的解决开辟了一条新途径.
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人α-肿瘤坏死因子基因在胆管癌细胞中的表达研究
我们利用阳离子脂质体、逆转录病毒载体介导人TNF-α基因转染进入胆管癌细胞,并实现了表达.1.材料和方法:(1)质粒和主要试剂:重组逆转录病毒huTNF-α质粒由宝生物大连公司提供;人胆管癌细胞按王曙光等[1]方法经胰酶消化、贴壁生长,以10%小牛血清和DMEM培养液中,在体积分数为5% CO2浓度、饱和湿度及37℃条件下培养;Lipofect AMINE reagent ,TransIT-LT1购自日本Mirus公司;G418购自美国GIBCO/BRL公司;huTNFα抗体购自中山公司;其他试剂为分析纯.PCR引物、huTNF-α基因序列测定均由大连TAKARA公司合成.
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腺病毒载体介导shRNA抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因表达的研究
磷酸二酯酶5型(PDE5)作为基因治疗勃起功能障碍(ED)的分子靶点目前已逐渐成为研究热点.我们构建了以大鼠PDE5(rPDE5)为靶基因的重组腺病毒表达载体,将重组腺病毒转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞后,通过细胞内转录产生的短发夹RNA(shRNA)来诱导针对rPDE5基因的RNA干扰(RNAi),并分别从mRNA和蛋白水平检测其对rPDE基因表达的抑制情况.现报告如下.
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逆转录病毒载体介导双自杀基因治疗肝细胞肝癌的研究
我们将2种重要的自杀基因TK与CD基因整合在一起,以脂质体和逆转录病毒为载体,介导转入肝癌细胞HCC-9903[1],大限度地消除肿瘤细胞对治疗药物的耐药性;同时,降低前药的毒副作用.
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重组复制缺陷型腺病毒载体介导bFGF基因治疗大鼠缺血皮瓣的实验研究
近年来生长因子转基因在治疗皮瓣远端缺血领域表现出广阔的前景,我们的实验旨在探讨局部应用以重组复制缺陷型腺病毒为载体的碱性成纤维细胞生长因子(Ad-bFGF)基因治疗,对大鼠缺血皮瓣生存的影响.
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基因重组和同源重组技术在生殖工程中的应用前景
从理论上讲,任何外源基因在载体介导下通过基因重组技术和同源重组技术均可以转移至体细胞、生殖细胞或早期胚胎细胞和胚胎干细胞(ES细胞)中.由于早期胚胎细胞具有全能性,因此,经过遗传重组可以获得包括生殖系在内的任何转基因组织.现仅就其应用价值做一简述.
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TGF-β1小干扰RNA影响人腹膜间皮细胞黏附胃癌细胞株SGC-7901的研究
目的:观察人腹膜间皮细胞转染TGF-β1小干扰RNA后对胃癌细胞株SGC-7901黏附的变化,探讨其治疗腹膜转移的作用.方法:使用线性化的pcPUR β icassette质粒构建针对TGF-β1基因的siRNA表达载体;采用胰蛋白酶-EDTA消化法,从人的腹膜组织中分离腹膜间皮细胞.将TGF-β1-siRNA载体转染人腹膜间皮细胞,以半定量RT-PCR和Western蛋白印迹方法检测转染后间皮细胞中TGF-β1表达水平的变化,以3H-TdR掺入实验测定腹膜间皮细胞和人胃癌细胞株SGC-7901之间的黏附变化.结果:电泳、DNA测序证实合成的siRNA基因序列正确并已准确克隆入pcPURβicassette载体.免疫组化染色结果显示腹膜间皮细胞角蛋白、波形蛋白表达阳性,而白细胞共同抗原(CD45)、第Ⅷ因子相关抗原阴性.与对照组比较,TGF-β1-siRNA载体能显著下调TGF-β1mRNA(0.779±0.091 vs 0.503±0.064,P=0.013)和蛋白(77.67±5.69 vs 29.33±6.03,P=0.001)在腹膜间皮细胞中的表达,间皮细胞黏附胃癌细胞的能力减弱.结论:载体介导的RNAi技术可成功地干扰TGF-β1在腹膜间皮细胞中的表达.同时,降低了间皮细胞黏附肿瘤细胞的能力,有望减少胃癌腹膜转移的发生.
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腺伴随病毒载体介导帕金森病猴基因治疗的实验研究
我们在以往的研究基础上,进一步探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病灵长类模型基因治疗实验结果.材料和方法:(1)腺伴随病毒(AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第一内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3 d后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.
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逆转录病毒载体介导的bcl-2反义RNA促进胃癌MGC-803细胞凋亡
bcl-2是Tsujimoto在Ⅱ型B细胞淋巴瘤中发现的一种基因,其过度表达能抑制撤退生长因子、射线、热休克、化疗药物、病毒及促凋亡基因等多种因素诱导的细胞凋亡 .bcl-2蛋白高表达赋予肿瘤细胞对多种化疗药物的抗性,导致化疗失败或复发.逆转bcl -2的表达可能提高化疗效果.我们将bcl-2的编码序列反向插入逆转录病毒表达载体中并转导实体瘤胃癌细胞株MGC-803,观察bcl-2反义序列对实体瘤肿瘤细胞的作用.
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载体介导shRNA对胃癌细胞株MKN45中C-met的抑制作用
目的 探讨载体介导短发夹核糖核酸(shRNA)对胃癌细胞株MKN45中原癌基因C-met的抑制作用.方法 9株胃癌细胞株分为转染组、阴性对照组和空白对照组, 各3侏.通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术, 观察转染24 h和48 h后, 原癌基因C-met的信使核糖核酸(mRNA)的CT值的变化;通过免疫印迹试验(Western blot), 观察转染后C-met的蛋白变化;通过四氮唑盐MTT比色法, 计算细胞存活率.结果 载体介导的C-met shRNA转染24 h和48 h后, RT-PCR结果 显示, C-met的mRNA抑制率分别为56%和88%;与空白对照组比较, C-met的蛋白表达水平明显下降, 转染后24 h [(0.812±0.105) VS (0.640±0.011)]、48 h[(0.811±0.103) VS (0.331±0.009)], 差异均有统计学意义(P<0.05);MTT比色法显示, 细胞存活率均有明显下降, 转染后24 h为65.9%, 48 h为59.6%.结论 载体介导的C-met shRNA不仅可降低胃癌细胞株MKN45中原癌基因C-met的mRNA及其蛋白表达水平, 而且对癌细胞的存活有明显的抑制作用.
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腺病毒载体介导的eNOS基因转移治疗猫贲门失弛缓症
贲门失弛缓症是一种食管动力障碍性疾病,以下食管括约肌(lower esophageal sphincter, LES)张力增高,食管体部正常的蠕动消失以及LES在吞咽时的松弛障碍为特征.近年研究表明[1-3],引起LES松弛的主要神经递质是一氧化氮(NO).由于贲门失弛缓症患者食管-胃底交界部缺乏一氧化氮合酶(NOS)神经,导致NO合成障碍,引起了LES张力异常增高和松弛障碍.目前可供选择的治疗贲门失弛缓症的方法包括手术治疗、气囊扩张及LES局部注射肉毒杆菌毒素等,但各有局限性,疗效有待进一步提高[4].本实验初步探讨了腺病毒表达载体介导eNOS基因转移对实验性贲门失弛缓症的治疗作用,以便为临床治疗贲门失弛缓症提供新的方法和思路.