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应用分子生物学方法鉴定6群肺炎链球菌血清型
目的：利用分子生物学方法，鉴定26株6群肺炎链球菌的血清型。方法利用6群肺炎链球菌荚膜多糖相关基因设计合成6对特异性引物，PCR扩增26株肺炎链球菌，并对PCR产物进行基因序列的测定及分析。结果26株肺炎链球菌cpsD蛋白229个氨基酸中有7个突变点，第220～222位均没有缺失；其中，19株肺炎链球菌具有与wciNα蛋白氨基酸序列完全一致的氨基酸组成，第150位均为Ala，第38位均为Asp，其余7株与wciNα蛋白氨基酸序列没有相似性，但与wciNβ蛋白氨基酸序列相似性超过99％；15株wciP蛋白第195位为Ser，11株wciP蛋白第195位为Asn。综合分析比对后，26株6群肺炎链球菌中，11株属于6A型肺炎链球菌，8株属于6B型肺炎链球菌，4株属于6 C型肺炎链球菌，3株属于6 D型肺炎链球菌。结论分子生物学方法可用于6群肺炎链球菌血清型的鉴定，为完善6群肺炎链球菌的菌种档案提供了实验依据。
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不同来源 HL60细胞用于调理吞噬杀菌试验的比较
目的：通过比较不同来源的HL60细胞分化后细胞的表面标志、活性及其对肺炎链球菌调理吞噬杀菌指数的动态变化，评价HL60细胞的来源对肺炎链球菌调理吞噬杀菌能力的影响。方法使用流式细胞仪连续监测来源于美国ATCC和中国科学院上海细胞研究所的HL60细胞在分化后1～7 d的表面标志CD11b、CD35和CD71的表达情况，并观察活细胞、凋亡细胞和死亡细胞的比例；同时使用两种不同来源的细胞检测09 CS和B 两份质控血清对肺炎链球菌血清型6B、7F、14和23F菌株的调理吞噬杀菌指数，同时观察09CS对13价结合疫苗血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V1、4、18C、19A、19F和23F菌株的调理吞噬杀菌指数。结果两种不同来源HL60细胞分化3～6d细胞的表面标志、活细胞比例均可达到国际实验室的要求指标；两份质控血清对检测菌株的调理吞噬杀菌指数均能稳定于质控范围之内；两种细胞检测的09 CS对13价肺炎链球菌结合疫苗血清型菌株的调理吞噬杀菌指数具可比性。结论两种来源不同的 HL60细胞分化3～6 d均能用于评价肺炎链球菌疫苗免疫血清的调理吞噬杀菌试验，这为调理吞噬杀菌试验及其标准化在国内的建立提供了便利。
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肺炎链球菌发酵过程中质控方法的应用
目的建立肺炎链球菌发酵过程中的质控方法。方法应用革兰染色镜检与荚膜肿胀试验监测菌种的退化及发酵罐染菌情况，或用于退化菌种的复壮；应用发酵过程中测定培养液光密度（ A600）的方法监测发酵状况、确定培养液初始浓度以及收获时间；应用血糖仪测定发酵过程中的葡萄糖含量，保证发酵过程中碳源的及时补充；应用渗透压仪检测发酵过程中培养液渗透压的变化，确定补料策略。结果确立了细菌革兰染色、荚膜肿胀试验、葡萄糖含量、渗透压、光密度（ A600）等作为肺炎链球菌发酵过程中的质控方法。结论实验研究中建立的肺炎链球菌发酵过程质控方法能够较好地监测和评价肺炎链球菌的发酵过程。
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含有P spA家族1和2的双价结合疫苗具抗广谱肺炎链球菌菌株和伤寒沙门菌的潜力
先前作者发现,无需添加佐剂,肺炎球菌表面蛋白A( PspA)与伤寒沙门菌Vi荚膜多糖结合可增强抗P spA的免疫应答。目前研究由P spA家族1或2的α螺旋区结合到Vi多糖组成结合物用于免疫小鼠,以检测它抗静脉注射的能致死的肺炎链球菌各种菌株的能力。包含P spA家族1成分的结合疫苗对P spA 家族1菌株的攻击提供了良好的保护作用,但对P spA 家族2菌株的攻击没有保护作用。同样,PspA家族2结合物对PspA家族2菌株的攻击有良好的保护作用,对P spA家族1菌株的攻击几乎没有保护作用。这个结果得到在包被有异源PspA的ELISA 板上观察到的PspA 抗体交叉反应水平低的现象的支持。细胞因子模式显示了对Vi和Vi-P spA结合物的混合性Th1/Th2免疫应答。结果表明,PspA α螺旋区与Vi多糖的结合物增强了其诱导保护性免疫应答的能力,并且基于P spAα螺旋区的疫苗应同时含有P spA家族1和2以实现广泛的交叉保护。
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常规接种卡介苗（BCG）引起免疫应答的非特异效应
BCG是世界范围内常接种的疫苗之一,它除了对结核病( TB )有预防作用外,研究表明,接种BCG还具有许多额外、有益的非特异性免疫效应,包括在高死亡地区降低由非TB引起的婴儿和儿童的整体死亡率。接种BCG引起的抗体应答,为研究BCG影响非相关抗原引起的免疫应答提供了机会。本研究比较了常规接种对已接种BCG和没有接种BCG的婴儿的抗体应答水平的影响。已接种BCG的婴儿来自于出生后就接种BCG的相关研究组,没接种BCG的婴儿来自于接种门诊。所有婴儿依澳大利亚国家免疫计划接受BCG常规接种。后一组婴儿免疫接种后(6个月),对抗肺炎链球菌抗体( anti-Pn Ps )、抗 B 型流感嗜血杆菌抗体( anti-Hib)、抗破伤风类毒素抗体( anti-TT)和抗乙肝表面抗原抗体( anti-HBs)进行了为期4周的检测。总共有127位父母同意他们的婴儿参加本次研究,有108位进行了后的分析(其中56位已接种BCG,52位没接种BCG),结果发现,已接种BCG的一组,其anti-Pn Ps IgG(针对所有血清型)、anti-Hib IgG和anti-TT IgG的几何平均浓度( GMC )高于没有接种BCG的一组。对于血清型9V (P<0.01)和18C ( P=0.04),其差异具有统计学意义。而 anti-HBs IgG,比较几何平均浓度( GMC),发现已接种BCG的一组要低于没有接种BCG的一组( P=0.03)。两组中大多数婴儿的抗体水平高于保护值。刚出生的婴儿接种BCG影响后来常规接种的抗体应答。本研究为资源匮乏的国家引入肺炎结合疫苗和新型结核病疫苗提供重要启示。
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肺炎球菌表面蛋白A不影响小鼠对百白破疫苗的免疫应答
肺炎球菌表面蛋白A( PspA)是一种抗肺炎链球菌的构成蛋白疫苗的很有希望的候选物。之前我们已经表明,全细胞百日咳疫苗( wP )对于PspA是一种很好的佐剂,在小鼠中诱导抗肺炎球菌感染的保护性应答。在巴西, wP 与白喉、破伤风类毒素( DTPw)及氢氧化铝(明矾)佐剂一起施用于儿童。在小鼠中P spA5-DTP 。的单一皮下注射剂量(配方包含得自进化支5的PspA和新一代DTPw,并含有低剂量的百日咳杆菌脂多糖和明矾)诱导高水平的全身P spA5抗体,并针对两种不同的呼吸道致命性肺炎球菌菌株攻击提供保护。在这里,我们评估针对了小鼠接种P spA5-DTP 。后对P spA5的黏膜免疫应答,以及对 DTP 抗原的免疫应答。 P spA5-DTP 。于小鼠皮下免疫,在呼吸道中诱导了高水平的抗-PspA5 IgG而不是IgA。另外观察到,接种后小鼠与对照组小鼠在受到攻击后,细胞涌入呼吸道黏膜的情况没有差异。接种DTP 。或P spA5-DTP 。的小鼠中循环的抗百日咳、抗破伤风和抗白喉抗体的水平是等价的。 DTP 。和 P spA5-DTP 。诱导的抗体在中和Vero细胞中白喉毒素的细胞毒时显示出相似的能力。此外,与P spA5组合丝毫不影响小鼠对百日咳杆菌和破伤风毒素的预防。我们的研究结果支持联合P spA-DTP疫苗的方案。
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5型肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的不同糖蛋白比与免疫原性的关系
实验中比较了以不同糖蛋白比结合的5型肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的免疫原性.以氨还原法制备的不同糖蛋白比的5型多糖结合疫苗分别经腹腔注射NIH小鼠,共免疫3次,间隔2周.末次免疫2周后采血分离血清,以间接ELISA测定血清抗体,t检验统计分析数据.结果显示,生理盐水组(R组)无免疫原性;5型荚膜多糖组(H组)免疫原性低,无免疫加强效应;结合疫苗M组、N组第1、2针有免疫加强效应,第2、3针无免疫加强效应,而F组和Q组的两针次间均有明显的免疫加强效应.说明5型肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的糖与蛋白比较高时能获得较好的免疫原性.
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不同剂量肺炎链球菌荚膜多糖与蛋白结合物的免疫原性比较
用肺炎链球菌19F型、23F型的荚膜多糖(C-PS)分别和破伤风类毒素(TT)蛋白结合,制备了两个型别的多糖-蛋白结合物(19F-TT,23F-TT).为探讨结合物的适免疫剂量,以10tμg多糖和含1μg、3μg、9μg、27μg多糖的结合物经腹腔免疫NIH小鼠,ELISA方法检测小鼠血清中多糖和含不同多糖的结合物所产生的特异性IgG抗体.结果在不同的剂量免疫小鼠后,3μg剂量组在免疫三针后可诱生高浓度的抗体,但随着免疫剂量的增加,9μg与27μg诱生的抗体浓度较3μg诱生的抗体浓度之间并无显著性差异.含多糖3μg的19F型和23F型多糖蛋白结合物剂量组可诱生高浓度的特异性IgG抗体.
关键词： 肺炎链球菌 荚膜多糖-蛋白结合物 免疫原性 -
肺炎链球菌18C型糖蛋白结合物的制备及其免疫原性
制备肺炎链球菌18C型荚膜多糖-破伤风类毒素结合物(CPS-TT),测定结合物的理化性质、抗原特异性及其在动物中的免疫原性.结果显示,结合物能与相应的多糖和破伤风抗血清形成明显的沉淀线,蛋白/多糖比率为1.86,结合物分子大小(Kd值)为0.058.注射小鼠后可诱导明显的抗体应答,而且随着注射针次的增加,抗体反应水平明显增高,显示加强效应.结果表明,制备的肺炎链球菌糖蛋白结合物抗原性良好,具有胸腺依赖性抗原的特性,在小鼠中显示较好的免疫原性.
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破伤风类毒素-细菌多糖结合疫苗中载体蛋白识别的结构性标志物
细菌性脑膜炎的全球负担主要是由于奈瑟脑膜炎球菌和肺炎链球菌的侵袭性感染造成的。发达国家在1987年引入b型流感嗜血杆菌( Hib )结合疫苗前,Hib是许多细菌性脑膜炎的病因。 Hib结合疫苗降低了Hib发病率达80%或更多,这依赖于疫苗的普及程度。单价脑膜炎球菌C群( MenC )疫苗于1999—2000年上市,在英国降低了由MenC引起的侵袭性脑膜炎球菌病90%以上。现在有3个上市的4价脑膜炎球菌结合疫苗,也能抗血清型A、W和Y,肺炎球菌结合疫苗可以抗多达13个引起疾病的血清型。由有荚膜细菌引起的显著高的死亡率和长期的后遗症已经使得这样的疫苗策略在全世界范围内广受欢迎。
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7价肺炎球菌结合疫苗对小于90天的婴儿侵袭性肺炎球菌性疾病的影响
背景：肺炎链球菌是一种非同寻常的尚不被十分了解的在幼小婴儿中引起侵袭性细菌性疾病的原因。本项研究目的在于测定7价肺炎球菌结合疫苗（ PCV7）对苏格兰和威尔士年龄小于90天的婴儿中侵袭性肺炎球菌病（IPD）的影响，并且描述了PCV7引入后这种疾病的临床特征。
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突尼斯儿童抗生素敏感性及肺炎结合疫苗血清型覆盖率十年观察
肺炎链球菌是全球5岁以内儿童罹患侵袭性传染病的主要原因之一，这项研究的目的是分析突尼斯儿科人群中肺炎链球菌分离物的抗生素抗性情况及血清型分布情况，并且精确测定肺炎球菌结合疫苗引入后的血清型覆盖率。这项研究是使用针对包括在7价、10价以及13价肺炎球菌结合疫苗中的其他血清型是特异的单价抗血清（ Statens血清研究所）通过Neufeld试验而进行的，这些血清型为6A、6B、7F、9V、18C、19A、19F及23F。在研究期间，从年龄范围自新生儿至16岁的儿科病人中获得了200份侵袭性肺炎球菌分离物和310份非侵袭性肺炎球菌分离物。在这510份分离物中，53．4％的分离物对青霉素的敏感性降低，与非侵袭性及侵袭性疾病相关的分离物的青霉素抗性较高，二者之比为0．606∶0．450。所有菌株对始霉素、万古霉素及磷霉素敏感。血清型14是常见的血清型（占22．2％），接下来是血清型19F（15．5％）和23F（10．3％）。所有菌株都经分型，7价、10价和13价疫苗覆盖的血清型的百分率分别为66．4％、73％和78％（针对侵袭性肺炎球菌分离物为76．1％，针对非侵袭性肺炎球菌分离物为79．8％，此项结果为使用13价结合疫苗而言）。作者建议应继续监测抗生素敏感性并仔细应用抗生素，引入新的结合疫苗将会大大有助于减少突尼斯儿童的肺炎球菌性侵袭性疾病的发生。
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脂质 A的磷酸基团是鼠伤寒沙门菌毒力的要素并发挥天然和适应性免疫作用
脂质A是革兰阴性菌外膜的一个关键组成部分，通过Toll样受体4（ TLR4）-MD2-CD14途径刺激促炎反应。它的内毒素活性依赖于酰基链的数量和长度以及其磷酸化的状态。在鼠伤寒沙门菌中，除去脂质A中的次级月桂酸酯或肉豆蔻酸酯链导致细菌的减毒和在体外的生长缺陷。然而，脂质A的这两个磷酸基团，在细菌毒力和免疫原性中所起的作用仍然未知。在这里，我们用携带有五酰基化脂质A的鼠伤寒沙门菌msbB pagL pagP lpxR 突变株为亲本菌株，构建了一系列合成1-去磷酸化、4′-去磷酸化，或非磷酸化五酰基化脂质A的突变株。去磷酸化的突变株对脱氧胆酸盐的敏感度增加了，及对多黏菌素B的抵抗力增强。去除两个磷酸基团的突变株在BALB／c小鼠口服用药时出现重度减毒，但突变株定植在淋巴组织，并具有足够的免疫原性以保护宿主免受野生型鼠伤寒沙门菌的攻击。小鼠接种含有1-去磷酸化或非磷酸化五酰基化脂质A的鼠伤寒沙门菌后细胞因子水平降低。减毒和去磷酸化的沙门菌疫苗能够诱导针对异源（肺炎链球菌的PspA ）和同源抗原［脂多糖（ LPS ）和外膜蛋白（ OMPs）］的适应性免疫。
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14型肺炎链球菌荚膜多糖纯化工艺中两种去除蛋白方法的比较
目的 苯酚抽提法和脱氧胆酸钠沉淀法去除14型肺炎链球菌荚膜多糖中蛋白质的效果比较.方法 将3批次14型肺炎链球菌发酵培养液经超滤、乙醇沉淀等方法初步纯化后,平分成两份,分别采用苯酚抽提法和脱氧胆酸钠沉淀法去除蛋白,通过比较多糖收获量、多糖组分检定结果、多糖分子质量、多糖抗原活性、多糖核磁共振图谱,以此评价这两种蛋白去除方法的效果.结果 与苯酚抽提法相比,脱氧胆酸钠沉淀法制备的14型肺炎链球菌纯化荚膜多糖除收获量较高,蛋白和核酸杂质含量较低外,氨基己糖含量、多糖分子质量、抗原活性和多糖核磁共振图谱的检定分析结果无显著性差异(P＞0.1).结论 作为14型肺炎链球菌荚膜多糖纯化工艺中的除蛋白方法,脱氧胆酸钠沉淀法优于苯酚抽提法.
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HL-60分化细胞表面标志、活性及其对肺炎链球菌调理吞噬杀菌能力的动态变化
目的 分析HL-60分化细胞的表面标志、活性及其对肺炎球菌调理吞噬杀菌能力的动态变化.方法 以流式细胞仪连续监测分化1 ～7d的HL-60细胞表面标志CD11b、CD35和CD71的表达以及活细胞、凋亡细胞和死亡细胞的比例,同时用09CS、QC2、B、C和F5份质控血清以调理吞噬杀菌试验检测肺炎链球菌血清型6B、7F、14和23F的杀菌滴度.结果 分化3～6d的HL-60细胞表面标志、活细胞比例可达到实验室要求,5份质控血清的调理吞噬杀菌滴度稳定而且在质控范围之内.结论 分化3～6d的HL-60细胞可以用于评价肺炎链球菌疫苗免疫血清的调理吞噬杀菌试验,为调理吞噬杀菌试验的建立和标准化提供了依据.
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合成肺炎链球菌荚膜多糖基因的研究进展
肺炎链球菌是导致婴幼儿和老年人罹患肺炎、脑膜炎、中耳炎等疾病的主要病原体之一，其致病力与位于细菌表面的荚膜多糖密切相关，而荚膜多糖层的薄厚和多糖结构是影响致病力的主要因素。在分子水平探索参与荚膜多糖合成的相关基因，不仅有助于进一步理解肺炎链球菌的致病机理，而且可从基因水平选育高表达荚膜多糖的肺炎链球菌菌株用于多糖疫苗的研发。鉴于此，现就合成肺炎链球菌荚膜多糖基因的作用机制和研究方法作一综述。
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烟曲霉菌、肺炎链球菌混合肺部感染1例
患者,女,58岁.缘于5d前受凉后出现胸痛,以胸骨后疼痛为主,持续性胀痛,咳嗽、呼吸时疼痛明显加剧.咳痰,痰量少呈深黄色带血性,黏稠不易咳出,胸闷、纳差,低热5d.2012 -03 -05在当地卫生院以慢性支气管炎治疗7d无效,转入本院.血常规示:WBC 11.0 × 109/L,N 0.87,胸部螺旋CT轴位扫描示:双肺感染,其余结果正常.入院后给予盐酸头孢替安治疗3d,仍有咳嗽、咳痰,痰量反而增多.第3天痰培养结果提示:烟曲霉菌和肺炎链球菌混合感染,改用伏立康唑6 mg/kg静脉注射,用药3d,咳嗽、咳痰明显好转,体温降至正常.1周后痰培养复查,未检出烟曲霉菌和肺炎链球菌,肺部DR胸片示阴影消失,患者痊愈出院.
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从脑脊液中检出多重耐药肺炎链球菌1株
抗生素的使用极大地降低了感染发生率和患者病死率,由于耐药菌株增多,使抗感染治疗面临诸多新困难.2006-08,我们从1例急性化脓性脑膜炎患者脑脊液中检出1株多重耐药的肺炎链球菌,现报告如下.
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耐青霉素性肺炎链球菌致急性化脓性脑膜炎1例
患者,男,16岁.因发热、头痛、呕吐6日,抽搐3 h就诊.3岁曾患结核性胸膜炎,8岁曾患结核性脑膜炎及外耳道流浓史.入院时患者呈急性谵妄状态,双肺可闻及大量痰鸣音,腹部(-).颈抵抗(卅),偏侧脑损害体征,Kernig's 征,Brudzinski's征均(艹).血常规示:WBC 37.0×109 /L,中性0.85.
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一株耐奥普托欣肺炎链球菌的分离与鉴定
目的:通过对我院患者痰液标本中分离出的一株形似肺炎链球菌的革兰阳性球菌进行鉴定,探讨仅单独使用奥普托欣(OP)敏感试验来鉴定肺炎链球菌的不足.方法:以形态学、奥普托欣(OP)敏感试验、胆汁溶菌等传统生化反应试验,以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对该菌进行鉴定.结果:该株细菌终被鉴定为肺炎链球菌且OP耐药.结论:肺炎链球菌的鉴定应综合使用多种鉴定方法以防止漏检.
