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甲基化荧光PCR检测母血中游离胎儿maspln因的研究
目的:探讨Taqman探针与甲基化特异性PCR(MSP)技术结合测定孕妇血浆中甲基化maspin(M- maspin)基因和非甲基化maspin (U -maspin)基因的可行性,并分析微量U-maspin的临床意义.方法:选择正常早、中、晚期妊娠妇女各30例为研究对象,健康未妊娠女性30例为对照,提取其血浆游离DNA.通过含目的基因质粒标准品绘制标准曲线,并应用甲基化荧光PCR方法检测各组血浆标本亚硫酸氢盐修饰后M-maspin基因和U-maspin基因的含量,分别代表母源性游离DNA和胎源性游离DNA水平.结果:除3例早期妊娠孕妇外,其余孕妇血浆中均检出了U maspin基因,平均浓度在早期妊娠组为57拷贝/ml,中期妊娠组为121拷贝/ml,晚期妊娠组为561拷贝/ml;占母源性M -maspin基因的比例分别为1.88%、3.21%、9.58%.结论:母血中U- naspin基因具有游离胎儿DNA的动力学特点,可能成为一种通用胎儿标记物,应用甲基化荧光PCR技术检测孕妇血浆中微量U-maspin基因方法准确、可行.
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TLR9介导DNA病毒的免疫识别
Toll样受体(toll-like receptor,TLR)是免疫细胞表面的模式识别受体(patttern recognition receptor,PRR),参与微生物病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)的识别,从而诱导天然免疫应答.迄今在人类已经确定了10个TLRs家族成员[1].不同的TLRs识别不同的PAMPs,如TLR9是免疫细胞识别病毒和细菌中非甲基化DNA的必需成分[2];TLR3是识别双链RNA(dsRNA)病毒的特异性受体[3].尽管TLRs在天然识别细菌和真菌中已经显示出了重要作用,但在体内抗病毒免疫的作用还不清楚[4].通过对TLR9与病毒感染相关性研究,为探讨HIV及HPV等DNA病毒致病机理和制备其基因疫苗开辟新的思路.
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增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展
CpG 基序(CpG motifs)是指含有非甲基化的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)核苷酸核心的寡聚脱氧核苷酸(ODN)序列,又称为免疫刺激序列,一般为 6 个寡聚核苷酸.1995年,Krieg 等[1]研究发现非甲基化的 CpG 二寡聚核苷酸是病原体 DNA 免疫刺激活性的结构基础,自此,对 CpG 基序的各种研究得以展开,包括 CpG 基序免疫刺激机制、CpG 基序个数及结构对免疫刺激活性影响、CpG 寡聚脱氧核苷酸作为佐剂使用等.
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不同因素对非甲基化CpG ODN佐剂活性的影响
CpG ODN即含有胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的寡脱氧核苷酸,研究发现,非甲基化的CpG ODN能够显著促进机体的特异性及非特异性免疫应答,是一种高效的TH1型疫苗佐剂,它的佐剂活性与其结构有着密切的关系.我们综合考虑了可能影响CpG ODN佐剂活性的6个因素,即骨架是否进行了硫代修饰、是否具有回文结构、CpG基序侧翼序列的种类、CpG基序数量的差异、是否含有5′-poly(A) 结构以及免疫时间的长短,利用正交试验设计合成了10种不同序列的CpG ODN(表1).
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DNA高甲基化与抑癌基因
哺乳动物基因组中,DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化.DNA甲基化是一种基因外修饰,不改变DNA的一级结构;他在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用.全基因组低甲基化,维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象.DNA高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制.本文综述了抑癌基因的高甲基化、DNA修复基因的高甲基化、甲基化与转录的关系以及导致转录失活可能存在的作用机制、寻找甲基化相关基因的依据原则、甲基化的检测方法、肿瘤甲基化图谱的特征、甲基化与突变的相互作用、导致甲基化产生的原因、及其广泛的应用前景.
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大肠癌相关基因甲基化研究
目前大肠癌已经成为危害人类健康的常见恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势.深入研究大肠癌发生发展的分子遗传学基础,干预、阻断和逆转其癌变过程,提高大肠癌的预防、诊断和治疗水平已得到人们的广泛重视.大肠癌的发生发展是一个涉及多种基因改变和多阶段致癌的复杂过程,包括癌基因、抑癌基因的改变(缺失、突变)、错配修复基因(Mismatch repair,MMR)的突变、DNA甲基化、微卫星不稳定性(Microsatellite instability,MSI).其中,DNA甲基化异常在大肠癌的发生发展中起重要作用.DNA甲基化主要是指DNA胞嘧啶5号位的甲基化改变,引起基因表达异常,而DNA顺序及基因产物不变.已证实,甲基化主要发生在富含CpG顺序的CpG岛,后者存在于所有主要基因中.非甲基化的基因处于转录活动状态,而甲基化时正相反,处于失转录状态[1].近年来,国内外对其研究较多.本文针对与大肠癌发生相关的癌基因与抑癌基因的甲基化研究现状作一综述.
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结肠癌分子治疗的靶:DNA甲基化和组蛋白乙酰化
DNA甲基化和组蛋白乙酰化是哺乳类动物重要的两种基因表达的后生调节方式.甲基化主要是指位于胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷(CpG)中的胞嘧啶为甲基基团所修饰.基因组中CpG积聚的区域谓之"CpG岛".生理情况下,多数基因的CpG岛是非甲基化的,而孤立的CpG则多半处于甲基化状态.基因的5′端(启动子区等)含有丰富的CpG岛,其甲基化则基因表达受抑制.甲基化是由甲基化酶(DNA methyltransferase,DNMT)1、3a和3b催化形成的.DNA和组蛋白共同构成染色质.组蛋白主要有H3、H4、H2A和H2B等.其乙酰化状态由组蛋白乙酰化酶(histone acetvlases,HATs)和去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)调控.一些转录因子如p300等具有HAT活性;同时丁酸盐和Trichostatin(TSA)等具HDAC的拮抗作用.两类物质都可使乙酰化水平上调,使染色质处于开放状态,便于DNA中的基因转录与表达.通常,甲基化的基因伴同相应的组蛋白去乙酰化;反之亦然.
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TLR9诱导产生的Ⅰ型IFN对实验性大肠炎的抑制作用
细菌DNA及其来源的具有免疫刺激效应的寡聚核苷酸(ISS-ODN)(含有非甲基化CpG基序)是TLR9的配体.ISS-ODN能够刺激Th1型细胞因子的产生,上调抗原提呈细胞表达共刺激分子,增强宿主对入侵病原微生物的防御功能.ISS-ODN能够防止或明显减轻CD4+T细胞依赖和CD4+T细胞非依赖实验性大肠炎的发生或炎症程度,但这种保护作用是短暂的,不具有免疫记忆效应,表明ISS-ODN介导的抗实验性大肠炎效应是天然免疫应答.通过T细胞和B细胞缺陷的SCID和RAG-/-小鼠,发现ISS-ODN对RAG-/-小鼠发生实验性大肠炎具有保护机制,而这种效应主要是通过ISS-ODN活化TLR9信号通路产生的Ⅰ型IFN来发挥作用.
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CpG ODN1826增强树突状细胞抗胃癌效应研究
近年研究结果 显示,含有非甲基化的CpG基序具有强大的免疫激活作用[1].前期研究表明,CpG ODN可增强树突状细胞(DC)对胃癌细胞株MKN45的杀伤作用[2].本研究旨在观察CpGODN诱导DC的抗胃癌效应.
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DNA甲基化异常与肿瘤
DNA甲基化是真核生物基因表达调控的一种方式.在哺乳动物,DNA甲基化发生在二核苷酸胞嘧啶(CpG)的第5位碳原子上,即5-甲基胞嘧啶(5-mc)[1].人类的CpG以两种形式存在,一种是分散于DNA中,另一种是CpG结构高度聚集的CpG岛.在正常组织里,70%~90%的散在的CpG是被甲基修饰的,而CpG岛则是非甲基化的[2].近年来的研究表明,DNA甲基化异常参与了肿瘤的发生、发展.
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儿童急性白血病p16基因甲基化研究
目的:探讨p16基因甲基化与儿童急性白血病(AL)的发生、发展、预后的关系.方法:用酶切加PCR技术研究33例初治儿童AL,15例复发儿童AL及30例对照组p16基因甲基化情况,并观察p16基因甲基化与化疗结果的关系.结果:33例初治AL有3例、15例复发AL有6例、30例对照组中0例存在p16基因甲基化.可评价疗效的31例初治AL中,3例甲基化患者均未缓解;28例非甲基化患者中3例获完全缓解,23例部分缓解,2例未缓解(总有效率92.86%).结论:①在初治儿童AL中p16基因甲基化率低,不是儿童AL的主要发病机制.②p16基因甲基化率儿童AL复发病例显著上升,值得重视,同时对指导治疗及预测病程和预后具有重要意义.
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Toll样受体9在狼疮肾炎患者肾组织中的表达及其临床意义
Toll样受体9(TLR9)能特异性识别内源或外源DNA中非甲基化的CpG-DNA基序,启动炎性应答信号通路,活化自身反应性T、B细胞并诱导自身抗体、炎性分子产生,近两年成为系统性红斑狼疮(SLE)的研究热点.
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TLR9的特性及其介导CpG DNA的信号通路
固有免疫应答细胞表面有限的受体如何识别种类繁多的异己抗原,一直是困扰医学界的一个难题.机体识别微生物非己成分是基于对病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMP)的识别.PAMP是多种微生物所共有的一类特殊的保守结构,其化学性质多属于糖脂结构,真核细胞一般不表达.目前已发现多种PAMP,包括G-菌的脂多糖、G+菌的肽聚糖、磷壁酸和脂磷壁酸、分支杆菌的脂聚糖和酵母菌的甘露糖等.近发现,细菌来源的非甲基化CpGDNA也是一种PAMP,其识别受体是Toll样受体(Tolllike receptor,TLR)家族成员--TLR9.本文就TLR9介导的CpGDNA信号传导机制作简要综述.