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TACE蛋白在动情周期和围着床期小鼠子宫内膜的表达规律
目的:初步探讨肿瘤坏死因子转换酶(TACE)蛋白在动情周期和早孕小鼠子宫内膜的表达规律.方法:用免疫组化SP法检测动情周期和早孕小鼠子宫内膜TACE蛋白的表达.结:TACE蛋白在各期小鼠子宫内膜呈规律性表达,动情周期中动情期与其它3期相比表达明显增强(P<0.001),妊娠期比动情期表达显著增强(P<0.001),孕d3、d4、d5、d6与孕d1、d2、d7相比表达显著增强(P<0.001).结论:TACE可能通过裂解多种细胞表面分子促进子宫内膜同步发育、胚胎粘着、侵袭等过程,在胚泡植入中发挥着重要作用.
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大鼠局灶性脑缺血再灌注后TACE mRNA表达变化的研究
目的研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时间脑皮质半暗带和中心区肿瘤坏死因子转换酶(TACE)转录水平的表达规律.方法用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,切取缺血半暗带及中心区皮质组织,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定TACE mRNA水平的变化.结果在脑皮层缺血半暗带及中心区脑组织,TACE mRNA表达变化有两个高峰,分别在脑缺血再灌注后3 h、12～24 h(P＜0.01),在脑缺血再灌注后72 h表达低于正常对照组(P＜0.05或P＜0.01),7、14 d未检测到TACE mRNA水平,21 d出现低水平表达.结论TACE mRNA过度表达可能对脑缺血再灌注后早期神经元死亡起促进作用.
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两类金属蛋白酶在炎性细胞模型中的变化及中药RDQ的天然抑制效应
目的 探讨金属蛋白酶(MPs)家族的MMPs和ADAMs两亚类成分在前体TNF-α (mTNF-α)向成熟型TNF-α (sTNF-α)转化过程所起的作用,MMPs在炎症过程中活性的变化和中药RDQ抗炎保护功效的分子机制,为人工干预炎症过程提供依据和手段.方法 以IPS刺激HL-60细胞为天然模型,用细胞学和分子生物学技术在蛋白质和mRNA水平上研究MMPs、ADAM17、TNF-α在炎症过程中的表达和活性变化.结果 ①LPS刺激后,HL50细胞上清中MMPs的活性随刺激时间延长逐渐减弱,胞浆裂解物中的MMPs则随刺激时间延长活性增加但LPS刺激对MMPs mRNA的表达影响不大;②LPS刺激能使HL-60细胞中ADAM17 mRNA和TNF-α mRNA表达在6 h同时达高峰;③RDQ能明显降低LPS诱导的ADAM17 mRNA的增加,并能抑制sTNF-α的分泌.结论 ①ADAM17对sTNF-α的产生起主导作用;②纯中药注射液热毒清(RDQ)能调节TACE的表达,终抑制TNF-α的分泌.
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TACE基因shRNA真核表达载体的构建及其对HeLa细胞生物学活性的影响
目的 构建靶向肿瘤坏死因子转换酶(TACE)的小发夹结构 RNA(shRNA)的真核表达载体,观察干扰TA-CE 表达对 HeLa 细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计针对 TACE 基因的 4 个 shRNA 序列,构建真核表达载体 shR-NA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4.通过酶切和测序等方法进行鉴定.转染 HeLa 细胞后,用 Reahime PCR 的方法检测其对 HeLa 细胞 TACE 基因表达的影响;用ELISA检测细胞分泌的 sTNF-α,间接反映干扰 TACE 的效果;用 MTT 法检测细胞增殖活性;用 DNA ladder 和流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建和筛选出了针对 TACE 基因的 3 个有效的特异性真核表达载体,且均在不同程度上抑制了 HeLa 细胞 TACE 基因的表达.ELISA 检测结果与 Reahime PCR实验结果相符.同时发现干扰 TACE 基因后,HeLa 细胞的生长受到抑制,凋亡率升高,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05).实验组转染 shRNA1～3 后 72 h 可见特征性的基因组 DNA ladder 条带.结论 所构建的TACE shR-NA 真核表达载体能显著抑制 TACE 的表达.干扰 TACE 基因的表达可有效抑制 HeLa 细胞的增殖并诱导其凋亡.
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LPS对金属蛋白酶的诱导表达及中药热毒清的保护机制
背景与目的:以肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor-α,TNF-α)前体向分泌型TNF-α转化过程为目标,探讨HL-60细胞中金属蛋白酶(Metalloproteinases,MPs)家族的基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)和解整合素金属蛋白酶(A disintegrin and metalloproteases,ADAM)两亚类成分参与炎症因子分泌的机理以及中药热毒清(Reduqing,RDQ)抗炎保护功效的分子机制.材料与方法:采用细胞毒性-MTT检测法、原位杂交、PAG-底物(明胶)电泳等方法分别检测HL-60、U937和小鼠腹腔巨噬细胞在大肠杆菌内毒素(LPS)及RDQ的作用下,MMPs、ADAM17、TNF-α基因转录水平和酶活性的变化.结果:①LPS刺激后,不同类型细胞的MMPs的表达量及电泳酶谱随刺激时间的延长变弱,而HL-60细胞培养上清的酶谱变化正好相反;②在HL-60细胞中与MMPs相比,ADAM17在前体TNF-α(pro-TNF-α)向分泌型TNF-α(s-TNF-α)转换中起着重要作用;③RDQ在细胞杀伤效应上、在ADAM17 mRNA表达水平上均能明显抑制LPS所诱导的s-TNF-α表达和分泌的增高作用(P＜0.01).结论:①在LPS刺激的TNF-α分泌中,MPs家族的ADAM17起主要作用,而针对解整合素结构域(Disintegrin)的探针对排除MMPs的干扰,真实反映ADAM17 mRNA表达水平更具特异性;②纯中药注射液RDQ的抗炎、解毒作用的靶标之一是拮抗LPS诱导的TACE mRNA活性增加.ADAM17成为炎症机制和治疗研究的新靶标.
