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角膜碱烧伤后乙酰肝素酶的表达及与新生血管的关系
许多角膜疾病均合并有角膜新生血管增殖(corneal neovasculaxization,CNV),CNV是角膜移植排斥反应的高危因素[1],是常见的致盲原因之一.大量研究表明,乙酰肝素酶(heparanase,HPA)对肿瘤新生血管形成[2-3]及创伤愈合过程中新生血管形成[4]起着非常重要的作用.
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重组人乙酰肝素酶在大肠杆菌中的表达、纯化
目的:表达纯化重组的人乙酰肝素酶 (heparanase,HPA).方法:以表达乙酰肝素酶全长质粒pcDNA3.1-HPA为模板,扩增不包括信号肽的乙酰肝素酶片段,将其插入pET-28a(+)载体,转化到大肠杆菌BL21(plysS,DE3)中,在起始诱导菌密度、诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度4个方面对诱导条件进行了优化,实现了重组人乙酰肝素酶的可溶性表达.采用HisTrapTMcrude亲和层析对目的蛋白进行了初步纯化.结果:得到了初步纯化的HPA蛋白,Western 印迹证实表达产物可被乙酰肝素酶抗体和His标签抗体识别,证明表达产物具有乙酰肝素酶的免疫学特性.结论:表达纯化的人HPA蛋白为特异性单抗的制备和鉴定提供了实验材料.
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乙酰肝素酶信号肽对其活性功能的影响研究
目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移过程中起关键作用,其信号肽在该酶翻译后处理过程中起重要作用.本研究旨在探索乙酰肝素酶在哺乳动物细胞中的表达特性及其信号肽对此酶功能活性的影响.方法:从人胎盘cDNA文库中扩增乙酰肝素酶全长编码基因,克隆入pGEM-T载体中,测序鉴定序列完全正确后,将此基因的全长和不含信号肽基因序列分别克隆入真核表达载体pcDNA4.1/Myc-His中构建pcDNA4.1/Myc-His full HPA和pcDNA4.1/Myc-His part HPA,转化COS-7细胞进行瞬时表达,分析这两种乙酰肝素酶蛋白的表达特性及功能活性.结果:在转染了乙酰肝素酶全基因的COS-7细胞裂解液中检测到该酶的功能活性及大小约53×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,为切割激活后乙酰肝素酶羧基端大亚基与标签蛋白的融合体.在转染了敲除信号肽的乙酰肝素酶基因的COS-7细胞裂解液中测到未被切割激活的大小约65×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,未能检测到该酶的功能活性.结论:在COS-7细胞中表达的完整的乙酰肝素酶蛋白和不含信号肽的乙酰肝素酶蛋白均位于细胞内,没有或很少被分泌到细胞外,提示该酶在正常状态下主要分布在细胞内.含信号肽的酶蛋白在翻译后处理过程中被细胞内的蛋白酶切割成2个亚基而被激活,具有功能活性.而不含信号肽的酶蛋白没有被切割而成为有活性的酶,提示乙酰肝素酶的信号肽对其翻译后加工、激活过程有重要的影响.
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乙酰肝素酶可变剪接体Splice5在CHO细胞中的稳定转染及其亚细胞定位研究
目的 建立乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株,并进行亚细胞定位分析.方法 将表达乙酰肝素酶全长的质粒和乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5质粒转染入CHO细胞,经G418进行筛选后,挑取单克隆进行培养,RT-PCR检测筛选克隆.用激光共聚焦显微镜测定其亚细胞定位.结果 成功获得乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5稳定转染株,并研究了其亚细胞定位情况.野生型乙酰肝素酶以颗粒状分布于细胞质中,Splice 5以弥散状分布于细胞质中,且在内质网、高尔基体、溶酶体、细胞膜均有分布.结论 Splice 5和野生型乙酰肝素酶在CHO细胞中分布形式和定位的不同,提示Splice 5可能具有其他的生物学功能.
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乙酰肝素酶、缺氧诱导因子-1α的表达与食管鳞癌浸润转移的关系
目的:探讨乙酰肝素酶(heparanase,HPA)及缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factors-1α,HIF-1α)在食管鳞癌中的表达及其与食管鳞癌浸润转移的关系.方法:应用原位杂交技术检测70例食管鳞癌组织和23例切缘正常组织中HPA mRNA表达,同时应用免疫组化法检测HIF-1α蛋白在全部标本中的表达.结果:癌组织中HPA mRNA和HIF-1α的阳性表达率分别为65.7%(46/70)和55.7%(39/70),显著高于切缘正常组织(P＜0.05);HPA mRNA和HIF-1α的表达与食管鳞癌组织浸润深度、淋巴结转移有关(P＜0.05);在食管鳞癌组织中HPA mRNA的表达与HIF-1α的表达关系密切(Kappa=0.615,P＜0.05).结论:HPA和HIF-1α阳性表达与食管鳞癌的生长及浸润转移有关,两者在食管鳞癌的发生、发展过程中可能存在着一定的协同作用;检测HPA与HIF-1α表达有助于食管鳞癌生物学性能的判断.
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重组人乙酰肝素酶多肽片段的表达与纯化
乙酰肝素酶(heparanase,HPA)是一种内源性β-葡萄糖醛酸酯酶,为迄今发现的唯一作用于细胞外基质多聚糖硫酸乙酰肝素蛋白多糖的内切酶[1].它能够特异性地识别硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)结构,并能将其降解为含10～20个糖单位的寡糖链[2,3].
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乙酰肝素酶和上皮钙粘蛋白-E在恶性黑素瘤中的表达及意义
目的 探讨恶性黑素瘤的发生和侵袭转移机制,检测乙酰肝素酶、上皮钙粘蛋白(E-cadherin)在恶性黑素瘤的表达及意义.方法 应用免疫组织化学SP法检测30例恶性黑素瘤、30例黑素细胞痣和20例正常皮肤组织中乙酰肝素酶和E-cadherin蛋白的表达.结果 乙酰肝素酶在恶性黑素瘤组织中表达的阳性率(63.33%)明显高于其在黑素细胞痣中的表达(6.67%),且其在正常皮肤组织中仅在皮脂腺腺体细胞中表达,其余细胞中不表达,两者比较有统计学意义(P<0.05);E-cadherin在正常皮肤组织表达(100%)与在黑素细胞痣中的表达(83.3%)无显著性差异,但明显高于其在恶性黑素瘤组织中的表达(43.33%),两者比较有统计学意义(P<0.05).结论 乙酰肝素酶和E-cadherin与恶性黑素瘤的转移有关,提示恶性黑素瘤组织中乙酰肝素酶和E-cadherin的检测可作为预测肿瘤转移的指标之一.
关键词： 恶性黑素瘤 乙酰肝素酶 E-cadherin -
乙酰肝素酶在大肠癌的表达及其意义
目的探讨大肠癌组织中乙酰肝素酶(heparanase,HPA)的表达特征及其与大肠癌侵袭和转移的关系.方法采用免疫组化SABC法,检测64例大肠癌组织中乙酰肝素酶蛋白的表达情况.结果64例大肠癌组织中乙酰肝素酶蛋白的阳性率为57.8%;乙酰肝素酶蛋白的阳性率在不同浸润深度分组和有无淋巴结转移分组的差异具有显著性(P＜0.05).结论乙酰肝素酶蛋白的表达可能在大肠癌侵袭和转移的过程中具有重要作用.
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乙酰肝素酶、碱性成纤维细胞生长因-子及组织蛋白酶D与子宫内膜癌的关系
目的 探讨乙酰肝素酶(Heparanase,HPSE)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth facto,bFGF)及组织蛋白酶D(Cathepsin D,Cath-D)与子宫内膜癌浸润、转移的关系.方法 采用免疫组化方法检测50例有完整随访资料的子宫内膜癌标本中HPSE、bFGF及Cath-D的表达情况,15例正常子宫内膜和10例非典型增生子宫内膜作为对照,数据用t检验及Spearman秩相关进行分析,总结出结果,找出HPSE、bFGF及Cath-D与子宫内膜癌的关系.结果 ①HPSE、bFGF及Cath-D从正常子宫内膜、非典型增生子宫内膜到子宫内膜癌三种组织的表达逐渐增加,有统计学差异(PHPSE＜0.05,PbFGF＜0.05,PCath-D＜0.05).②HPSE、bFGF及Cath-D在手术病理分期Ⅱ～Ⅲ期中表达显著高于I期者,有脉管浸润及淋巴转移阳性标本中三种指标均高表达,有统计学差异(均P＜0.05).③HPSE与bFGF表达呈正相关(相关系数r＝0.408,P＜0.05);Cath-D与bFGF表达呈正相关(相关系数r＝0.628,P＜0.05).结论 HPSE、bFGF及Cath-D的表达可能与子宫内膜癌的发生、浸润及转移有密切相关性,三者联合检测对评估子宫内膜癌患者预后有重要作用.
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乙酰肝素酶在食管癌中的表达及其意义
目的:探讨乙酰肝素酶在食管癌中的表达及其意义.方法 应用免疫组化法检测5 4例食管癌组织及32例正常食管组织中的表达情况.结果 乙酰肝素酶(Heparanase;HPS)在54例食管癌中的阳性率61.11%,显著高于32例正常食管组织中的阳性率13.33%(P＜0.05).乙酰肝素酶的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和病理分期相关(P＜0.05).乙酰肝素酶的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的部位、大小、组织学类型、分化程度无显著相关(P＞0.05).结论 本研究结果表明乙酰肝素酶的表达对血管生成、食管癌的侵入转移起到关键性的作用,其作为食管癌治疗中的一个新靶点对治疗及预后有相当好的理论价值.
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乙酰肝素酶--癌症转移治疗的靶点
近年来研究表明,乙酰肝素酶与癌症组织的转移有极为密切的相关性,通过抑制乙酰肝素酶可以阻止癌细胞的转移,提示乙酰肝素酶可成为癌症转移治疗的靶点.
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卡拉胶寡糖与 bFGF 的结合活性及其对乙酰肝素酶活性的抑制作用
为探讨卡拉胶寡糖作为硫酸肝素类似物的抗肿瘤和抗血管新生机制,以宫颈肿瘤细胞 HeLa 和人脐静脉内皮细胞 HUVEC 为研究对象,考察几种不同聚合范围的寡糖结合 bFGF 及抑制乙酰肝素酶活性的作用.发现卡拉胶寡糖对正常细胞和肿瘤细胞均表现出低毒特征.在低浓度下,具有结合 bFGF 并能抑制 bFGF 引起的细胞增殖能力,其中λ-卡拉胶寡糖(聚合度2～8)效果明显,在质量浓度为 20μg·mL-1 时,可达30%的抑制率.几种寡糖对乙酰肝素酶活性有不同趋势的抑制作用,在 HeLa 细胞中,λ-卡拉胶寡糖的抑制活性高;在 HUVEC 细胞中,聚合度在9～17的k-卡拉胶寡糖活性高.结果表明,卡拉胶寡糖的类硫酸肝素生物活性与其分子量大小、硫酸取代量有明显的关系,低分子量、高硫酸基取代是其高活性的关键.
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顺铂联合肝素酶抑制剂对鼻咽癌细胞增殖和侵袭迁移的影响
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是东南亚和我国南方地区高发的恶性肿瘤,占头颈部肿瘤发病率首位.早期淋巴结转移是其主要特征,其病因与Epstein-Barr virus (EB病毒)、遗传、环境及饮食等多种因素有关.鼻咽癌以低分化鳞癌为常见,目前放射治疗联合化疗为首选治疗方法.由于放疗设备和技术的不断进步及放化疗的综合应用,使疗效有所提高,5年生存率可达75％[1].但由于鼻咽癌具有生长迅速及高转移性,仍有近50％的患者因局部复发和远处转移而治疗失败[2].近年来,我国恶性肿瘤的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势,尤其是肿瘤发生发展后期出现侵袭转移是患者死亡率上升的主要原因之一.因此,研究侵袭转移机制,发现新的治疗靶点是肿瘤研究热点之一.
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卵巢癌中乙酰肝素酶蛋白的表达及临床意义
目的 研究卵巢癌中乙酰肝素酶(HPSE)蛋白的表达状况及临床意义.结果 采用免疫组化PV-6000法检测HPSE蛋白在卵巢癌、卵巢良性肿瘤和正常卵巢皮质中的表达,结合卵巢癌的临床病理特征进行分析.结果 HPSE蛋白在卵巢癌组织的表达高于对照组(卵巢良性肿瘤和正常卵巢皮质),差异有显著性(P<0.05),有淋巴结转移的癌组织HPSE高于无淋巴结转移组(P<0.01),TNM 分期Ⅲ～IV的癌组织表达高于I～Ⅱ组(P<0.01),均有高度统计学意义.结论 HPSE的高表达可能在卵巢癌的发生发展中起重要作用,HPSE可作判断卵巢癌生物学行为和预后的参考指标.
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长梗秦艽酮体外抗肿瘤活性及其作用机制探讨
目的 研究长梗秦艽酮体外抗肿瘤活性,探讨其部分作用机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)法观察长梗秦艽酮对BEL-7402,HeLa,BXPC-3,PANC-1细胞增殖的影响,流式细胞术分析其对BEL-7402细胞周期的影响,Western blot法检测其对ERK1/2蛋白激酶磷酸化的作用,RT-PCR法检测其对p53和乙酰肝素酶(heparanase)的mRNA表达水平的影响.结果 长梗秦艽酮能够显著抑制4种肿瘤细胞的生长.长梗秦艽酮作用于BEL-7402细胞后能够引起S期细胞周期阻滞,激活ERK1/2磷酸化而对p38磷酸化没有影响,上调p53的mRNA表达水平,抑制乙酰肝素酶的mRNA表达.结论 长梗秦艽酮具有显著的抗肿瘤活性,其作用机制可能与激活ERK1/2信号通路及上调p53基因从而诱导细胞周期阻滞和抑制乙酰肝素酶的表达有关.
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乙酰肝素酶在妊娠期高血压疾病大鼠肾脏的表达及低分子量肝素干预治疗
目的 观察妊娠期高血压疾病大鼠肾脏组织中乙酰肝素酶的表达变化及低分子量肝素的干预效应,探讨乙酰肝素酶在妊娠期高血压疾痛肾脏损害发生过程中的作用.方法 建立正常妊娠大鼠模型,妊娠期高血压疾病模型大鼠和低分子量肝素干预大鼠模型,采用免疫组化SABC法测定3组模型孕21d肾脏组织中乙酰肝素酶的表述.结果 与正常妊娠组相比,妊娠期高血压疾病模型组大鼠肾脏组织中乙酰肝素酶的表达显著升高(P＜0.01),平均动脉压和尿蛋白排泄明显增加(P＜0.01).与妊娠期高血压疾病模型组相比,低分子量肝素干预组大鼠肾脏组织中乙酰肝素酶的表达显著降低(P＜0.01),平均动脉压和尿蛋白排泄明显降低(P＜0.01).结论 肾脏组织中乙酰肝素酶的表达与妊娠期高血压疾病肾脏损害的发生发展有关,低分子量肝素对妊娠期高血压疾病肾脏损害具有一定的防治作用.
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乙酰肝素酶在子痫前期孕妇胎盘中的表达研究
目的 探讨乙酰肝素酶在子痫前期孕妇胎盘中的表达及其与病情轻重的关系.方法选取患者共43例,分为正常对照组13例,子痫前期轻度组15例,子痫前期重度组15例,采用Western-blot检测孕妇新鲜胎盘组织中乙酰肝素酶的表达情况.结果在3组标本中均有Hpa蛋白表达,子痫前期轻度及重度组明显高于正常对照组(P < 0.001),且子痫前期重度组与轻度组比较差异有统计学意义(P < 0.001).结论子痫前期孕妇胎盘中Hpa的含量明显高于正常对照组,且随病情加重而愈加显著.
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乙酰肝素酶在肝素干预的自然流产模型鼠胎盘中的表达及意义
目的:比较正常妊娠模型大鼠,自然流产模型大鼠,肝素干预模型大鼠胎盘组织中乙酰肝素酶表达特征的差异,探讨其与自然流产的关系.方法:建立正常妊娠大鼠模型,自然流产模型大鼠和肝素干预大鼠模型,采用免疫组化SABC法测定三组模型孕14 d胎盘组织中乙酰肝素酶的表达.结果:与正常妊娠模型组和肝素干预模型组相比,自然流产模型组大鼠胎盘组织中乙酰肝素酶的表达显著升高,P＜0.01.结论:胎盘组织中乙酰肝素酶的表达与自然流产的发生发展有关,肝素可对自然流产起到一定的预防和治疗作用.
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血管内皮生长因子与乙酰肝素酶在膀胱癌中的研究进展
1971年Folkman[1]提出肿瘤生长依赖血管生成假说.从血管生成的角度,将恶性肿瘤的发展分为血管生长前期和血管生长期两个阶段.众所周知,肿瘤的生长和转移必须依赖丰富的营养供给,组织中血管生成为营养物质供给奠定了重要的基础.临床试验和动物实验都证明,如果没有新生血管来供应营养,体外培养的肿瘤组织生长体积不超过4 mm3,而体内肿瘤不超过2 mm3[2].因此血管生成是肿瘤生长和转移的必备条件,与肿瘤的发生、发展和转移有着密切的关系.在肿瘤血管生成中起作用的众多因子中,当前研究多、受重视的是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF).
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胃癌乙酰肝素酶表达和DNA含量流式细胞定量研究
目的 探讨胃癌中乙酰肝素酶(heparanase)的表达及DNA含量与胃癌临床病理特征的关系.方法 应用流式细胞术检测50例胃癌组织、25例癌旁组织和10例正常组织中乙酰肝素酶的表达和DNA含量.结果 heparanase在胃癌组、癌旁组、正常组中表达量(FI值)分别为1.86±0.44,1.22±0.45,1.00±0.21,3组间差别有显著性(P＜0.05),heparanase在胃癌中的阳性表达率为96%,明显高于癌旁和正常胃黏膜(P＜0.01),且与胃癌的浸润深度(P＜0.05)、TNM分期(P＜0.01)和淋巴结转移相关(P＜0.01).3组的DI值分别为1.26±0.14,1.05±0.14,1.00±0.11,3组间差别有显著性(p＜0.05),且与肿瘤的分化程度和淋巴结转移相关(P＜0.01).Heparanase表达的FI值与DI值呈正相关关系(r=0.536,P＜0.01).结论 Heparanase在肿瘤的浸润和转移中扮演重要的角色,DNA含量与肿瘤的恶性程度密切相关.heparanase和DNA含量可能是评价胃癌恶性程度和预后预测的重要指标.
