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乙酰肝素酶抑制剂对体外培养视网膜色素上皮细胞增殖的影响
目的:探讨乙酰肝素酶(heparanase-1,HPA-1)抑制剂应用对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增殖的影响.方法:采用DMEM培养基(Dulbecco's modified eagles medium,DMEM)体外培养人RPE细胞,选择第5代细胞用于实验.倒置显微镜下直接观察不同质量浓度硫代磷酸甘露醇戊糖(phosphomannopentaose sulfate,PI-88)对人RPE细胞体外生长的干预效果,应用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny1 tetrazolium bromide,MTT]比色法检测RPE细胞A570值;免疫组织化学方法检测人RPE细胞角蛋白和HPA-1表达.结果:体外增生的RPE细胞胞浆和细胞核HPA-1呈强阳性表达,以细胞浆内表达为主,PI-88干预后细胞浆表达减弱.PI-88对体外RPE细胞的增生有明显的时效和量效抑制关系,药物干预72h细胞A570值随质量浓度不同表现明显下降趋势(P<0.05);而同一质量浓度,药物质量浓度达到100mg/L及以上时,48～72h才表现A570值减小的趋势.结论:HPA-1抑制剂可抑制体外培养RPE细胞的增生,并呈现剂量和时间依赖关系.
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乙酰肝素酶在口腔鳞癌发生发展中的表达和功能
目的:研究乙酰肝素酶(heparanase, Hpa)在口腔鳞癌(oral squamous-cell carcinoma,OSCC)中的表达及其与微血管密度(microvessel density, MVD)的关系,从而了解Hpa在OSCC血管生成、浸润和转移中的作用.方法:选用人正常口腔黏膜组织10 例,口腔白斑15 例,OSCC标本48 例,采用免疫组化方法和原位杂交技术检测Hpa的表达,用CD31抗体进行血管内皮的免疫组化染色,计数MVD.结果:在口腔白斑组织中Hpa蛋白、Hpa mRNA的阳性表达率均显著高于它们在正常口腔黏膜组织中的表达(P均＜0.05),并显著低于它们在OSCC中的表达(P均＜0.05).有淋巴结转移组和肌层浸润组的OSCC组织Hpa蛋白和mRNA的阳性表达显著高于无淋巴结转移组和黏膜及黏膜下层浸润组(P均＜0.05).Hpa蛋白、Hpa mRNA阳性表达的OSCC组织中MVD显著高于阴性表达组(P均＜0.05).结论:Hpa在OSCC中呈高表达,与血管生成密切相关,对OSCC的生长、浸润和转移有促进作用.
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乙酰肝素酶和核转录因子кB在涎腺肿瘤中的表达及其临床意义
目的:检测涎腺肿瘤中乙酰肝素酶(HPA)和核转录因子кB(NF- κB)的表达,探讨两者之间的关系及其临床意义.方法:采用免疫组化SP法检测42例涎腺良性肿瘤、44 例涎腺恶性肿瘤中HPA和NF- κB表达.结果:HPA和NF- κB在涎腺恶性肿瘤组中阳性表达率分别为61.4 %和65.9%,显著高于涎腺良性肿瘤组(P<0.05).HPA和NF- κB在涎腺恶性肿瘤中的表达与肿瘤的局部侵袭性、有无区域淋巴结或远处转移相关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤发生部位、临床分期无关(P>0.05).HPA 的表达与NF- κB 的表达呈正相关(r=0.7602, P<0.05).结论: NF- κB在体内可能参与了HPA的表达调控,并与HPA协同作用促进涎腺恶性肿瘤的侵袭和转移.
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小肝癌CT动脉期强化特征与乙酰肝素酶等生物学指标关系的研究
目的 探讨小肝癌动脉期强化特征与相关病理学及生物学指标的关系.方法 回顾性分析经手术病理证实的CT动脉期明显强化与无明显强化的小肝癌病例各35例,对照分析其病理学分级、血管生成情况及乙酰肝素酶(HPA)表达情况.结果 小肝癌CT动脉期明显强化与无明显强化2组间微血管密度(MVD)、HPA表达有统计学意义(P<0.05),与病理学分级无统计学意义(P>0.05).结论 小肝癌CT动脉期强化水平与其血管生成情况等生物学行为密切相关,可作为诊断及预后判断的有效指标.
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人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达
目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移、血管生成、组织发生等过程中起重要作用,其羧基端大亚基蛋白是该酶的重要组成部分,但由于此蛋白在体内含量少,易降解,很难直接从组织内得到一定数量的蛋白. 本研究利用工程菌表达乙酰肝素酶的大亚基蛋白以期得到相当数量的蛋白,以便进一步用于该酶的抗体制备和功能研究. 方法:从人胎盘cDNA文库中分离乙酰肝素酶蛋白全长编码基因,通过PCR和酶切等方法将乙酰肝素酶大亚基的基因克隆入原核表达载体pGEX-2TK中,测序鉴定序列完全正确后,转化大肠杆菌BL21(PlyS,DE3)进行表达. 结果:工程菌BL21(PlyS, DE3, pGEX-2TK-50 ku HPA)成功表达出乙酰肝素酶大亚基融合蛋白. 诱导1 h后工程菌即开始表达大亚基融合蛋白,在诱导3 h后表达蛋白量达到高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解. 诱导剂IPTG的浓度对其表达量及其表达形式无显著影响. 此蛋白的表达形式主要为包涵体形式. 低温诱导可见少量可溶蛋白存在. 结论:在大肠杆菌中成功表达了大亚基的融合蛋白. 此蛋白可以用于进一步乙酰肝素酶的抗体制备、免疫鉴定、功能活性等研究.
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乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选
目的:构建并筛选有效的、编码2条shRNA的乙酰肝素酶(Hpa)特异性基因真核表达载体. 方法:分别设计、化学合成6对寡核苷酸单链,经退火、连接和磷酸化后得到Hpa-shRNA双链,将两两随机间隔4～8个碱基后定向克隆入带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, EGFP)基因和Neo基因的pGenesil-1中,构建3 条含两段Hpa基因shRNA的pGenesil-1-Hpa-shRNA真核表达载体,转染卵巢癌细胞株SKOV3,流式细胞仪和荧光显微镜下观察转染效率,免疫组化分析Hpa蛋白表达. 结果:酶切与测序证实pGenesil-1-HPSE-shRNA构建成功,无任何碱基突变,3组质粒转染细胞均有Hpa表达的变化,3种不同shRNA质粒转染细胞后Hpa蛋白表达有明显差别. 结论: 构建并筛选了针对Hpa特异性的双基因shRNA真核表达载体pGenesil-1-Hpa-shRNA.
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人肝癌组织中乙酰肝素酶基因的克隆与序列分析
目的: 研究乙酰肝素酶在人肝癌细胞生长和转移中的作用,并自人肝癌组织中克隆该酶cDNA全长编码片段. 方法: 提取人肝癌细胞总RNA,以RT-PCR方法获取了乙酰肝素酶cDNA片段,将其与pGEM-T Easy载体连接,进行克隆及酶切鉴定. 结果: 序列分析表明,与GenBank中的人乙酰肝素酶全长cDNA序列比较,仅16个碱基不同,同源性为0.991. 结论: 自人肝癌组织中成功克隆了乙酰肝素酶cDNA全长编码片段.
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阻滞eIF-4E对乙酰肝素酶mRNA核浆转运及其表达的影响
目的:确定结肠癌LS-174T细胞中过量表达的真核细胞起始因子-4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF-4E)是否影响乙酰肝素酶(heparanase)mRNA的核浆转运,并改变乙酰肝素酶表达水平. 方法:脂质体包裹与eIF-4E mRNA翻译起始点互补的asODN转染人大肠腺癌细胞LS-174T. 使用Western blot, RT-PCR方法分别检测eIF-4E被阻抑后其转录和翻译水平的改变. 乙酰肝素酶mRNA在细胞内核浆分布水平采用Northern blot检测,其蛋白表达采用Western blot检测. 结果:asODN转染显著抑制eIF-4E基因和蛋白表达. 伴随eIF-4E被阻抑,Northern blot结果显示更多乙酰肝素酶mRNA滞留在细胞核,且其蛋白表达量也下降. 结论:阻抑eIF-4E可影响LS-174T细胞乙酰肝素酶mRNA核浆转运,并降低乙酰肝素酶蛋白表达. 此反义策略可应用于实验性和临床抗人类大肠癌转移的基因治疗.
关键词： 转染 真核细胞起始因子4E 乙酰肝素酶 信使RNA 核浆转运 -
胃癌组织中肝素酶mRNA的表达意义
目的:探讨肝素酶mRNA在胃癌及其癌旁组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系. 方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肝素酶mRNA在47例手术切除的胃癌组织及癌旁组织中的表达. 结果:胃癌组织中肝素酶表达阳性率明显高于相应的癌旁组织(74.5% vs 19.1%, P<0.01). 肝素酶阳性表达率与胃癌患者的肿瘤直径、有无淋巴结转移、浸润深度以及TNM分期有关,而与胃癌患者的年龄、性别、分化程度及有无远处转移无关. 结论:肝素酶的高水平表达促进了胃癌的生长、浸润及转移,与胃癌预后不良有关系.
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乙酰肝素酶在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义
目的 研究乙酰肝素酶在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组化SP法检测43例子宫内膜癌组织、31例子宫内膜增生症组织及20例正常子宫内膜组织中乙酰肝素酶蛋白的表达.结果 乙酰肝素酶在正常子宫内膜组织、增生症组织及子宫内膜癌中的表达呈上升趋势,3组间表达有显著性差异(P<0.01).在子宫内膜癌中,乙酰肝素酶表达与手术-病理分期(FIGO)(P<0.05)、组织病理学分级(P<0.05)和肌层浸润程度(P<0.01)具有明显相关性.结论 乙酰肝素酶可能与子宫内膜癌的发生发展有关,有望作为判断子宫内膜癌生物学行为和预后的参考指标.
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超早期小骨窗微创脑出血清除术后血清VEGF、Ang-1、HPA水平变化及意义
目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)及乙酰肝素酶(HPA)在预测超早期小骨窗微创治疗脑出血清除术后的意义.方法:选取进行治疗并行超早期小骨窗微创脑出血清除术的30例脑出血患者为为实验组,另选取同期于我院进行健康检查的30例健康者为对照组,分别于实验组术后24 h、48 h、5 d和10 d四个时间点采取实验组患者静脉血,对照组于健康检查次日清晨采静脉血,对两组患者血中VEGF、Ang-1、HPA水平进行对比,并于上述4个时间点使用格拉斯哥昏迷评分(GCS)、Berg量表和NIHSS量表对两组患者的神经功能进行测定对比,分析血清因子的变化与患者功能的相关性.结果:实验组治疗后,随着时间的推移,其血清因子水平不断下降,但较对照组仍处于高水平.随着时间推移,实验组患者GCS、Berg量表及NIHSS量表得分呈现上升趋势,提示患者功能得到逐步恢复.结论:对脑出血患者实施超早期小骨窗微创脑出血清除术后,其血清VEGF、Ang-1、HPA水平逐步下降,其神经、生活功能不断恢复,提示血清VEGF、Ang-1、HPA的水平对预测手术预后具有一定意义.
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乙酰肝素酶基因表达对人卵巢癌细胞系侵袭转移能力的影响
目的:探讨乙酰肝素酶的基因表达,对卵巢癌细胞转移侵袭能力的影响.方法:用Boyden小室体外侵袭实验比较两株卵巢癌细胞HO-8910和HO8910-PM的体外侵袭能力强弱;采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和原位杂交检测细胞乙酰肝素酶mRNA的表达情况;用MTT观察细胞生长能力的变化.结果:MTT检测结果显示卵巢癌细胞HO8910-PM细胞生长速度较快,而HO-8910细胞生长速度较慢.RP-PCR提示及原位杂交结果提示乙酰肝素酶在高转移性HO8910-PM细胞中表达强于转移性HO-8910细胞.Boyden小室体外侵袭实验表明,卵巢癌细胞HO8910-PM体外侵袭力较强,其穿膜细胞数为20.1土0.312,而HO-8910细胞体外侵袭力较弱,其穿膜细胞数为11.3±0.024.两者差异具有显著性意义(P＜0.05).结论:乙酰肝素酶基因的表达,能促进瘤细胞的生长和转移能力.
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质粒pcDNA3.1-asHpa的构建及意义
目的:构建乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体,探索恶性肿瘤基因治疗的新途径.方法:以质粒pcDNA3.1为载体,将乙酰肝素酶信号密码的DNA片段反向插入其多克隆位点得到反义乙酰肝素酶信号密码真核表达载体(pcDNA3.1-asHpa).结果:经过PCR扩增鉴定、电泳证实获得的重组基因的大小和插入方向正确.结论:成功的构建了乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体,可以进一步用于反义基因表达的实验研究.
关键词： 基因表达调控 乙酰肝素酶 @信号密码 @反义基因 @pcDNA3.1载体 -
E-选择素、乙酰肝素酶与胃癌的研究
胃癌作为一种恶性肿瘤，具有浸润转移的特点，发病率和死亡率都非常高。胃癌的转移途径主要是原发肿瘤部位的癌细胞脱落，继而侵袭邻近组织引起临近组织发生肿瘤侵润；或通过血液循环及淋巴循环系统，引起远处肿瘤种植。在胃癌所致的肿瘤侵润和远处种植过程中，肿瘤细胞、细胞外基质(ECM)、基底膜(BM)和肿瘤细胞的黏附力的相互作用可以说是贯穿始终的，肿瘤细胞入侵和穿出循环系统时，都必须穿过基底膜，所以E-选择素以及能破坏 ECM和 BM的乙酰肝素酶在肿瘤侵袭转移中更为重要。本文就E-选择素、乙酰肝素酶在胃癌中的有关研究作一综述。
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乙酰肝素酶在原发性肝癌中的研究进展
原发性肝细胞癌(简称肝癌)是我国主要恶性肿瘤之一。乙酰肝素酶（heparanase，HPA)基因是哺乳动物细胞中唯一能够能特异性识别、切断基质中硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proglycan，HSPG)的硫酸(乙酰)肝素(HS)侧链的基质降解酶。大量实验证实乙酰肝素酶在原发性肝癌中高表达，并促进肿瘤的浸润和转移[1]。本文对乙酰肝素酶在原发性肝癌转移和扩散中的研究进展做一综述。
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S-100和HPA蛋白在涎腺腺样囊性癌组织中的表达及意义
目的：探讨 S?100和 HPA 在涎腺腺样囊性癌（ SACC）中的表达以及在嗜神经侵袭和转移方面的意义．方法：采用免疫组化SP法检测44例涎腺腺样囊性癌中S100和HPA的表达．结果：S?100与HPA在腺样囊性癌（ SACC）中的表达与肿瘤嗜神经侵袭性、局部侵袭性和远处转移相关（P＜0．05）；与患者的年龄、性别和临床分期无关（P＞0．05）．结论：S?100与HPA蛋白在腺样囊性癌的嗜神经侵袭与远处转移中起重要作用．
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乙酰肝素酶、碱性成纤维细胞因子与非小细胞肺癌血管生成及转移的关系
全世界每年约有131万人死于肺癌, 我国是肺癌高发区,因肺癌死亡者仅次于胃癌,居第二位.肿瘤血管新生、浸润和转移是影响非小细胞肺癌预后的重要因素[1].碱性成纤维细胞因子(BFGF) 是目前所知的重要的促血管生长因子,在肿瘤血管新生中起重要作用.非小细胞肺癌中普遍存在BFGF的高表达,并且和较差的预后[2]、肿瘤进展[3]、血管新生[4]、淋巴浸润和转移[5]相关.在肿瘤血管新生、浸润和转移过程中,不断伴随着新蛋白的合成.这些新蛋白不但为肿瘤细胞增殖、生长所必需,对于血管内皮细胞的增殖也很重要.因此,作为蛋白翻译起始所必需的mRNA帽结合蛋白,乙酰肝素酶(HPs)与肿瘤的血管新生[6]、恶性转化和转移[7]密切相关.HPs表达升高能促进一系列血管新生相关蛋白如BFGF的翻译,因此我们推测:非小细胞肺癌中BFGF和HPs的表达存在着相关性,并且和非小细胞肺癌的分化、分期、血管新生、浸润和转移相关.笔者通过检测131例非小细胞肺癌组织中HPs、BFGF的表达,以探讨其在非小细胞肺癌的发生、发展及转移中的作用,并分析2者的相互关系,以便为非小细胞肺癌的早期诊断、有效治疗及预后提供重要的科学依据.
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乙酰肝素酶及E-钙黏蛋白对胃癌侵袭转移的影响
目的 探讨乙酰肝素酶及E-钙黏蛋白对胃癌侵袭转移的影响.方法 收集2005年2月至2007年5月辽宁省肿瘤医院手术切除的50例胃癌标本.采用RT-PCR法检测乙酰肝素酶mRNA及E-钙黏蛋白mRNA在胃癌组织中的表达,同时应用免疫组织化学法检测E-钙黏蛋白在胃癌组织中的表达.计量资料采用方差分析和t检验;计数资料采用χ~2检验.结果 乙酰肝素酶与E-钙黏蛋白的表达在胃癌的细胞分化程度、淋巴结转移、TNM分期方面比较,差异有统计学意义(t=1.999,4.258,1.735;1.286,6.794,3.091;χ~2=6.273,9.397,5.640,P<0.05).乙酰肝素酶阳性/E-钙黏蛋白阴性与未分化型、淋巴结转移及TNM Ⅲ、Ⅳ期有关(χ~2=11.306,10.208,8.420,P<0.05).结论 乙酰肝素酶在胄癌组织中的表达增高,E-钙黏蛋白在胃癌组织中表达降低,乙酰肝素酶与E-钙黏蛋白的异常表达具有协同作用,两者同时异常表达使胃癌细胞具有更强的侵袋转移能力.
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慢病毒携带shRNA对乳腺癌HPA基因表达的抑制作用
目的:以乙酰肝素酶(HPA)基因为靶点,构建短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,研究慢病毒携带的shRNA对乳腺癌HPA基因表达的抑制作用.方法:以乳腺癌HPA基因为靶基因,根据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,通过构建3对shRNA重组慢病毒的表达载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,在体外采用蛋白质印迹(Western blot)法检测HPA基因蛋白表达水平;在体内构建乳腺癌模型,通过免疫组化检测HPA基因蛋白的表达.结果:在体外实验中,HPA-shRNA-1组和HPA-shRNA-2组均有效抑制了人乳腺癌MDA-MB-231细胞HPA的表达.在体内实验中,HPA-shRNA-2组HPA基因蛋白的表达明显低于阴性对照组及空白对照组,HPA-shRNA-2组阳性率与空白对照组比较,差异有统计学意义(x2=12.504,P<0.05).表明在体内实验中HPA-shRNA-2组可以下调HPA基因蛋白表达.结论:以HPA为靶点构建shRNA重组慢病毒载体,体内外实验均能下调乳腺癌HPA基因的表达,可为乳腺癌靶向治疗提供新的靶点.
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乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶-2在胰腺癌组织表达及其与神经浸润的关系
目的 探讨乙酰肝素酶(HPSE)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在胰腺癌中的表达及其与神经浸润的关系.方法 采用免疫组织化学双标技术检测47例胰腺癌组织及10例正常胰腺组织中HPSE和MMP-2的表达,观察HPSE、MMP-2的阳性表达率与神经浸润的关系.结果 胰腺癌组织中HPSE及MMP-2的阳性表达率分别为59.57%和65.96%,明显高于正常胰腺组织(20.80%和25.00%),差异有显著意义(χ2=9.59、8.56,P＜0.05).HPSE和MMP-2阳性表达率在有神经浸润的胰腺癌组织中分别为72.41%和86.21%,均高于无神经浸润者(38.89%和33.33%),差异有显著性(χ2=5.183、13.828,P＜0.05).结论 HPSE和MMP-2在胰腺癌神经浸润过程中发挥重要作用,其检测可作为反映胰腺癌生物学行为的重要指标.
