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Syndecan-1和乙酰肝素酶在胃癌淋巴结转移中的相互作用
胃癌的侵袭和转移涉及多个步骤,其中穿越由细胞外基质和基底膜组成的屏障是必不可少的一步.该屏障主要由两种成分构成:一是结构蛋白,二是糖氨聚糖,后者的主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG).乙酰肝素酶(HPA)基因编码的蛋白质是惟一降解HSPG硫酸肝素(HS)侧链的核苷内切酶[1].我们先前的研究显示,HPA mRNA表达与胃癌淋巴结转移有关,且可能通过与CD44v6和基质金属蛋白酶(MMP)-7的协同作用参与胃癌的侵袭转移[1].
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乙酰肝素酶在胃癌组织中的表达及临床意义
癌细胞侵袭和转移的一个重要机制是降解基底膜和细胞外基质结构.硫酸乙酰肝素降解性糖苷内切酶的激活与肿瘤细胞转移有关,这在鼠B16-Fl0黑色素瘤细胞在血管内皮细胞细胞外基质上的培养试验中被证实[1].Takaoka等[2]采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化方法在临床标本和细胞中证明乙酰肝素酶的表达与胃癌的侵袭性和预后不良有关.
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乙酰肝素酶基因转染SKOV3细胞对细胞增殖、黏附、侵袭能力的影响
背景与目的:乙酰肝素酶(heparanase,HPA)是能降解细胞外基质和基底膜的β-D-葡萄糖醛酸内切酶.HPA在人类正常组织局限于胎盘和免疫器官有表达,但在许多恶性肿瘤中有高水平的表达,促进了肿瘤的侵袭和转移.本文探讨乙酰肝素酶基因转染卵巢癌SKOV3细胞后对细胞生长、黏附、侵袭能力的影响.方法:以携带HPA基因的质粒(pCDNA3.0-HPA)经脂质体介导转染SKOV3细胞.RT-PCR法检测转染后HPA mRNA表达水平;MTT法检测SKOV3细胞生长曲线及细胞与细胞外基质的黏附;同质黏附试验和细胞分离试验检测细胞间的黏附和分离能力;利用transwell小室检测卵巢癌细胞SKOV3细胞的侵袭能力;流式细胞仪测细胞周期;免疫组化法检测卵巢癌细胞中HPA蛋白表达.结果:与对照组和空载组比较,转染组HPA mRNA水平上调,差异有显著性(t=-128.726,-96.959,P＜0.01);细胞周期中S期指数明显增多;细胞生长曲线显示细胞生长速度增快;对细胞外基质的黏附率明显升高(t=11.824,11.234,P＜0.01);同质黏附率降低(t=-14.455,-18.348,P＜0.01);细胞分离率增强(x2=869.847b,796.068b,P＜0.01);穿透重组基底膜的细胞数目显著增高(t=11.964,12.263,P＜0.01);细胞浆中的HPA蛋白表达显著上升.结论:转染HPA基因可以促进卵巢癌细胞的生长增值,增强卵巢癌细胞的侵袭转移能力.
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PI-88抑制人食管癌TE-13细胞Matrigel裸鼠移植瘤血管新生及其机制
目的:探讨通过Matrigel与肿瘤细胞混合接种的方法构建裸鼠人食管癌Matrigel移植瘤模型的可能性,进一步研究抗肿瘤制剂PI-88对于人食管癌Matrigel移植瘤生长及血管新生的影响.方法:将食管鳞癌细胞株TE-13悬液与Matrigel胶混合,接种8只裸鼠,构建人食管癌TE-13细胞Matrigel裸鼠移植瘤模型,将其随机分为PI-88治疗组和对照组.治疗组按照20 mg/kg剂量皮下注射PI-88,1次/d(PI-88配成1 mg/ml溶液);对照组按照20 ml/kg注射生理盐水,1次/d,均连续给药2周.第2、6、10、14天记录裸鼠肿瘤体积,第15天进行增强CT扫描观察肿瘤区域显影情况.免疫组化染色观察肿瘤组织中乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达.结果:8只裸鼠均在接种当天形成移植瘤,成功构建TE-13细胞Matrigel裸鼠移植瘤模型.PI-88治疗第14天时,治疗组肿瘤体积明显小于对照组[(70.25 ±6.85) vs (143.13±17.18) mm3,P＜0.05].治疗第15天时,治疗组肿瘤区域CT值明显低于对照组(15.18±0.91vs 19.23±2.03,P＜0.05).治疗组肿瘤组织内HPSE与VEGF表达阳性细胞数显著低于对照组[HPSE:(28.70±6.39) vs(87.55±22.03)个,t=11.472,P＜0.01;VEGF:(47.10±8.18) vs (94.40±14.47)个,t=12.727,P＜0.01].结论:Matri-gel胶混合食管癌细胞接种裸鼠制备移植瘤方法可行,PI-88能够抑制人食管癌TE-13细胞Matrigel裸鼠移植瘤生长及血管新生,其作用机制可能与PI-88抑制移植瘤组织中HPSE和VEGF表达有关.
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乙酰肝素酶反义寡核苷酸对肺癌A549细胞黏附、侵袭和凋亡的影响
目的:探讨乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人肺癌A549细胞黏附、侵袭和凋亡的影响.方法:设计并合成HPSE特异性ASODN (HPSE-ASODN),脂质体介导转染A549细胞.Western blotting检测A549细胞中HPSE蛋白的表达.黏附实验和侵袭实验检测HPSE-ASODN对A549细胞黏附和侵袭的影响,Hoecht 3222染色法检测HPSE-ASODN对A549细胞凋亡的影响.结果:与对照组和脂质体组相比,HPSE-ASODN转染下调A549细胞中HPSE蛋白的表达,且显著抑制A549细胞的黏附和侵袭(P＜0.01)；HPSE-ASODN转染可诱导A549细胞凋亡,凋亡率明显高于未转染组和脂质体组[(44.7±18.9)％ vs (1.2±3.3)％、(5.8±20.1)％,P＜0.01].结论:HPSE-ASODN能下调肺癌A549细胞中HPSE蛋白的表达,抑制A549细胞的黏附和侵袭,诱导其凋亡.
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乙酰肝素酶与肿瘤转移
乙酰肝素酶是一种内源葡萄糖醛酸酶，与肿瘤转移密切相关，近3家实验室独立地克隆出其基因，为研究肿瘤转移开辟了一个很有潜力的领域。随着有关乙酰肝素酶分子生物学特性、调节因素、抑制剂等方面研究的不断深入，乙酰肝素酶很可能成为抗癌药物的靶子。
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抗人乙酰肝素酶单克隆抗体联合紫杉醇对人乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响
目的:探讨抗人乙酰肝素酶(heparanase,HPA)单克隆抗体(简称单抗)联合紫杉醇(paclitaxel,PTX)对乳腺癌MCF-7、MCF-7/F5和MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法:应用反转录-PCR (reverse transcription-PCR,RT-RCR)法检测抗人HPA单抗对MCF-7、MCF-7/F5和MDA-MB-231细胞HPA mRNA表达水平的影响;MTT法检测不同浓度的抗人HPA单抗、PTX或抗人HPA单抗联合PTX干预对乳腺癌细胞增殖能力的影响;FCM法、细胞划痕实验和Transwell小室法分别检测抗人HPA单抗、PTX或抗人HPA单抗联合PTX干预对乳腺癌细胞的细胞周期、细胞迁移和细胞侵袭能力的影响.结果:10和20nmol/L抗人HPA单抗干预后,MCF-7/F5和MDA-MB-231细胞中HPAmRNA的表达水平明显低于鼠IgG组(P值均＜0.05).抗人HPA单抗和PTX单独处理后,MCF-7、MCF-7/F5和MDA-MB-231细胞的增殖受到抑制,且呈剂量依赖性(P值均＜0.05).抗人HPA单抗联合PTX处理后,3组细胞的增殖抑制率均高于任一单药处理组(P值均＜ 0.05).抗人HPA单抗联合PTX处理后,3组细胞中Go/G1期细胞所占百分比明显低于溶剂对照组(只加培养液),G2/M期细胞所占百分比明显高于溶剂对照组(P＜0.05,P＜0.01),且出现亚二倍体峰.抗人HPA单抗合PTX处理后,MCF-7/F5和MDA-MB-231细胞的迁移能力和侵袭能力低于溶剂对照组、鼠IgG组和任一单药处理组(P值均＜0.05).结论:抗人HPA单抗联合PTX可协同抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其作用机制可能与二药联合作用后将细胞阻滞于G2/M期有关.
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斑蝥酸钠维生素B6对肝癌SMMC-7721细胞中乙酰肝素酶表达的抑制作用
目的:探讨斑蝥酸钠维生素B6 (sodium cantharidinate and vitamin B6,SCAVB6)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡和侵袭及乙酰肝素酶(heparanase,HPA)表达的影响.方法:0.5、1.0、1.5和2.0 μg/mL SCAVB6作用肝癌SMMC-7721细胞24、48和72 h后,应用MTT法检测细胞的增殖情况.0.5、1.0、1.5和2.0μg/mL SCAVB6作用肝癌SMMC-7721细胞48 h后,FCM法检测细胞的凋亡情况,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力,RT-PCR和蛋白质印迹法检测细胞中HPA mRNA和蛋白的表达水平.结果:SCAVB6能够抑制SMMC-7721细胞的增殖,且具有一定的浓度和时间依赖性(P＜0.05).SCAVB6作用48 h后,肝癌SMMC-7721细胞的凋亡率高于对照组(SMMC-7721细胞未进行任何干预),而侵袭能力低于对照组(P值均＜ 0.05).1.0、1.5和2.0 μg/mL SCAVB6作用后,SMMC-7721细胞中HPA mRNA和蛋白的表达水平低于对照组,且呈浓度依赖性(P值均＜ 0.05).结论:SCAVB6可抑制SMMC-7721细胞的增殖和侵袭,这一作用可能与抑制HPA的表达有关.
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沉默乙酰肝素酶对人胃癌细胞侵袭迁移能力的影响
目的:探讨RNA干扰沉默乙酰肝素酶(heparanase, HPA)基因表达对人胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响.方法:根据人HPA基因序列转录RNA的位置及小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)设计原则,设计了4个靶位点,并构建了4个分别针对靶位点的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的质粒表达载体,同时合成了阴性和阳性对照质粒表达载体.采用阳离子脂质体法将以上质粒转染入人胃癌SGC-7901细胞,分别采用RT-PCR和Western印迹法检测转染前后HPA mRNA和蛋白表达的变化,选出对HPA沉默效果佳的质粒,再应用Transwell小室基质侵袭实验和划痕损伤实验分别研究HPA表达沉默后对人胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移能力的影响.结果:质粒载体pGPU6/GFP/Neo-HPA-1085沉默人胃癌SGC-7901细胞HPA mRNA和蛋白表达的效果好.pGPU6/GFP/Neo-HPA-1085转染组中穿透Transwell小室基质的SGC-7901细胞数(289.90±18.11)明显高于对照组(44.00±15.22) (P<0.05),SGC-7901细胞的迁移距离在48、72和96 h内 pGPU6/GFP/Neo-HPA-1085转染组明显低于对照组(P<0.05). 结论:RNA干扰技术可沉默人胃癌SGC-7901细胞中HPA mRNA和蛋白表达,从而抑制SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力.HPA可能是治疗胃癌侵袭和转移的一个新靶点.
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双基因shRNA干扰乙酰肝素酶在卵巢癌细胞中表达的实验研究
目的:采用编码2条短发卡式RNA(shRNA)的抗乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)特异性载体干扰卵巢癌细胞中Hpa的表达,观察其对肿瘤生长转移的抑制作用.方法:以脂质体介导的方法将自行设计和构建的抗Hpa短发卡式RNA(Hpa-shRNA)基因真核表达载体稳定转染人卵巢癌细胞SKOV3;流式细胞仪鉴定转染效率,免疫组化和实时定量RT-PCR检测转染前后卵巢癌细胞中Hpa蛋白和mRNA表达,Boyden小室观测细胞增殖和侵袭能力的变化,透射电镜观察卵巢癌细胞超微结构改变.结果:Hpa mRNA表达在SKOVa-Hpa(转染Hpa)明显升高(P＜0.01),SKOV3-Hpa shRNA(转染Hpash RNA)显著降低(P＜0.01),SKOV3 DZ-shRNA(转染非特异性sh RNA片段)和SKOV3无显著性差异(P＞0.05).电镜下,SKOV3-Hpa组Hpa蛋白表达为明显,SKOV3-Hpa shRNA Hpa蛋白则低,各组间比较差别有显著性意义(P＜0.01).SKOV3-Hpa细胞器发达,细胞表面绒毛丰富,细胞间连接稀少.SKOV3 Hpa-shRNA以变形为主,细胞表面绒毛少,细胞器不发达,部分见线粒体皱缩,肿胀和空泡样改变.SKOV3-Hpa、SKOV3-DZ-shRNA和SKOV3-Hpa-shRNA 3种细胞穿过人工基底膜的细胞数分别为82.3±9.16,36.1±8.73和18.6±10.5,各组间比较有显著性差异(P＜0.01).结论:双基因Hpa特异性shRNA可显著抑制卵巢癌细胞Hpa表达,降低细胞侵袭能力.
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HPA与CXCR4的表达及其与肝癌浸润转移的关系
目的:探讨乙酰肝素酶(heparanase,HPA)和趋化因子受体CXCR4在肝癌细胞中的表达及其与肝癌浸润转移的关系.方法:应用免疫组织化学方法检测HPA和CXCR4在肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达,并分析其与肝癌临床病理学特征的关系.结果:在肝癌组织HPA和CXCR4的表达均显著高于癌旁及正常肝组织;HPA在肝癌组织中的表达与肿瘤大小、有无肝内或淋巴结转移及肿瘤分化程度有关(P＜0.05);CXCR4在肝癌组织中的表达与有无癌栓及有无肝内或淋巴结转移有关(P＜0.05);肝癌组织中HPA与CXCR4的表达呈显著正相关(r=0.313,P=0.027).结论:HPA与CXCR4可能在肝细胞癌的发生发展、浸润转移中发挥着重要的协同作用.
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乙酰肝素酶、CD44v6在骨肉瘤组织中的表达及其相关性研究
目的: 探讨乙酰肝素酶(heparanase,HPA)、细胞黏附分子CD44v6在骨肉瘤组织中的表达及二者的相关性.方法:应用免疫组织化学染色的方法检测人骨肉瘤组织中HPA和CD44v6的表达.结果: HPA在骨肉瘤组织中表达阳性率为79.6%,CD44v6表达阳性率为55.1%,均显著高于骨软骨瘤中的20.0%和25.0%(P＜0.05).HPA表达与CD44v6表达呈显著正相关(r=0.663,P＜0.001),两者表达与骨肉瘤临床分期、转移密切相关.结论: HPA和CD44v6在骨肉瘤组织中高表达可能促进肿瘤的黏附、侵袭和转移.
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乙酰肝素酶在食管鳞状细胞癌组织中的表达与意义
目的:探讨乙酰肝素酶在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的表达及其与ESCC临床病理特征间的关系.方法:应用RT-PCR和免疫组化方法检测55例ESCC术后组织标本及相应癌旁组织中乙酰肝素酶的表达,分析乙酰肝素酶表达与ESCC临床病理特征的关系.结果:ESCC组织中存在乙酰肝素酶基因的表达,并定位于肿瘤细胞质和(或)细胞膜中.55例ESCC组织中有40例乙酰肝素酶基因mRNA表达阳性(40/55,72.7%),癌旁组织有19例表达阳性(19/55,34.5%),两组间差异有显著性(P＜0.01).免疫组化染色ESCC组织中乙酰肝素酶阳性率63.6%(35/55),癌旁组织阳性率21.8%(12/55),两组间差异有显著性(P＜0.01).乙酰肝素酶基因mRNA和蛋白质的检测均显示有淋巴结转移的癌组织乙酰肝素酶表达高于无淋巴结转移组,TNM分期Ⅲ～Ⅳa的癌组织表达高于Ⅰ～Ⅱ组,均有统计学意义.结论:ESCC组织乙酰肝素酶基因及蛋白表达高于正常组织,并且与ESCC的转移和进展有密切关系.
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乙酰肝素酶--癌细胞浸润、转移的一个关键酶
癌症成为人类致命的疾病,不仅在于癌细胞的生长失去控制,更在于其具有转移能力,而转移癌细胞通常是真正的杀伤细胞.癌细胞的转移,即其进入血管以及再穿出血管进入其它组织,必须穿过细胞层以及环绕在细胞层外的稠密基质.细胞外基质和血管基底膜中含有大量硫酸类肝素,可以封阻癌细胞移动.乙酰肝素酶(heparanase, hpa)是一个关键胞外基质降解酶,它降解硫酸乙酰肝素和乙酰肝素蛋白聚糖上的聚糖侧链,在肿瘤浸润和转移中起重要作用.
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乙酰肝素酶在头颈部恶性肿瘤中表达的研究进展
肿瘤细胞的侵袭和转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因,寻找引发肿瘤细胞侵袭和转移的因素并进行有效阻断是治疗肿瘤的重要方法之一.癌细胞的侵袭和转移必须穿过细胞层以及环绕在细胞层外的稠密基质.乙酰肝素酶(heparanase,HPA)是一种能降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和基底膜(basement membrane,BM)的酶,在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用[1].HPA通过降解ECM和释放其结合的生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factors,bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等,加速肿瘤侵袭转移、新生血管形成这二个肿瘤发展的关键环节[2],从而促进肿瘤的发展.本文就此相关文献作一综述.
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乙酰肝素酶调控大鼠肝再生机制探讨
目的 探讨乙酰肝素酶(HPSE)调控大鼠肝再生的机制.方法 设计合成HPSE小干扰RNA(siRNA),以in vivo-jetPEI-Gal为载体转染70％肝切除大鼠,转染后免疫组化检测大鼠肝组织肝细胞生长因子(HGF)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达,蛋白质印迹法检测肝组织基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白的表达,Ⅷ因子免疫组化检测肝组织微血管密度(MVD).结果 使用siRNA干扰HPSE后,大鼠肝组织中HGF、VEGF蛋白的表达降低,MVD降低,MMP-2和MMP-9表达降低,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 HPSE可通过释放激活细胞外基质(ECM)中的HGF促进肝细胞增殖、增加VEGF的表达加速血管生成以及上调MMP-2和MMP-9的表达等途径调控大鼠肝再生.
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人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析
目的 构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体,并分析其活性.方法 PCR扩增人类基因组DNA HPSE启动子核心片段,并测序鉴定和分析转录因子结合位点(TFBS).双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点,构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp.将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP-Hp及质粒pEGFP-1(阴性对照)和pEGFP-N1(阳性对照)分别转染正常人脐静脉内皮细胞(ECV)和不同的肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性自血病K562细胞).荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性.结果 扩增的HPSE启动子核心片段长度为561 bp,序列分析与GenBank收录一致,含有3个SP1、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N-myc和NGFI-p300等TFBS各1个.重组质粒pEGFP-HP经酶切和测序鉴定与预期结果 一致.荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达;转染pEGFP-N1细胞均有强荧光表达;转染pEGFP-Hp质粒的ECV几乎无荧光表达,HepG2和Hep2细胞有较强荧光,K562细胞仅有较弱荧光.流式细胞术检测表明,pEGFP-Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.9%、21.3%、10.8%和6.5%,pEGFP-N1转染率分别为17.1%、24.0%、14.0%和11.0%,二者比值均小于1.结论 成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体.该载体可在肿瘤细胞特异性表达,但其活性需进一步加强.
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光辉霉素A对人胃癌BGC823细胞增殖、凋亡、迁移的影响及其机制
目的 观察光辉霉素A(MIT)对人低分化胃癌BGC823细胞增殖、凋亡、迁移的作用,以及对转录因子Sp1和乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)表达的影响,并探讨其可能的机制.方法 采用不同浓度的MIT作用于胃癌BGC823细胞,以Cell Counting Kit-8(CCK8)法测定对细胞增殖的影响;以流式细胞仪测定对细胞凋亡的影响;以细胞划痕法观察对细胞迁移能力的影响;以实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法定量测定细胞内Sp1和Hpa mRNA表达的变化.结果 MIT抑制胃癌BGc823细胞增殖的效应呈浓度和时间依赖性(P均＜0.05);不同浓度(0、0.15、0.30、0.60 μmol/L)的MIT作用于胃癌BGC823细胞24h后,细胞的凋亡率随药物浓度的增加而增加,分别为(2.100 ±0.985)、(13.533 ±0.777)、(21.533 ±0.874)、(27.500±0.964)％,即MIT促进胃癌BGC823细胞的凋亡呈浓度依赖性(P ＜0.05);MIT对胃癌BGC823细胞迁移的抑制作用具有量效和时效性;胃癌BGC823细胞Sp1和Hpa mRNA表达量随MIT浓度的增加而降低(P均＜0.05).结论 MIT对胃癌BGC823细胞增殖、凋亡、迁移影响可能通过抑制Sp1、Hpa的表达而实现.
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乙酰肝素酶在膜性肾病中的研究进展
乙酰肝素酶作为哺乳动物中唯一可以剪切硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的酶,在人体内通过剪切硫酸乙酰肝素蛋白聚糖释放成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、结缔组织因子等活性物质,发挥不同的生物学作用.在膜性肾病中,乙酰肝素酶通过剪切肾脏基底膜表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,不仅削弱了肾脏的电荷屏障,从而导致大量蛋白尿的产生,而且还引起基底膜对H因子的招募作用减弱,从而过度激活旁路途径,导致肾脏进一步损伤.随着对乙酰肝素酶研究的深入,越来越多的证据显示,乙酰肝素酶还可通过增强组织因子和Ⅹ因子的活性和浓度水平造成凝血系统紊乱,导致高凝状态甚至血栓事件的产生.该文主要综述乙酰肝素酶在膜性肾病中的作用及相关研究进展.
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乙酰肝素酶促进脑缺血后血管发生
乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)是哺乳动物体内唯一能降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的β-D-葡萄糖醛酸内切酶.研究证实,Hpa可促进多种病理生理学过程的血管发生,但有关脑缺血后Hpa表达和作用的研究仍然较少.文章重点介绍了Hpa与脑缺血后血管发生的关系.
