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反义寡核苷酸对HL60细胞c-myc基因表达的抑制和分化诱导作用及凋亡作用的研究
目的和方法:原癌基因c-myc广泛存在于各型白血病细胞,在人早幼粒白血病细胞系HL60细胞中表达高.其表达水平随细胞的增殖而增加,随细胞的分化成熟而下降.HL60细胞在不同的诱导剂作用下可向不同的方向分化,如:DMSO、RA等可诱导其向粒细胞方向分化;TPA、1,25-(OH)2 Vitamin D3、DCA等可诱导其向单核/巨噬细胞方向分化.
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转染血管内皮细胞生长因子受体基因(Flt/Ig)对K562白血病细胞在体内生长影响的研究
目的:绝大多数肿瘤细胞均可产生血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),它刺激间叶细胞形成新生血管,为肿瘤的生长提供营养.近发现,白血病和骨髓瘤时骨髓血管密度也增加,缓解后仍高于正常.
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IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞的新策略
目的:利用细胞因子-受体的特异性结合来靶向杀伤肿瘤是新一代导向杀伤策略.鉴于白血病细胞异常高地表达IL6/IL6R系统,而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实,我们率先在国际上开展了利用IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨.方法:1. IL6-PE40的构建、表达及纯化:常规进行RNA提取、RT-PCR、质粒提取、酶切、回收、连接、转化、鉴定IL6、PE40及IL6-PE40融合基因的序列分析等.将所构建的含IL6-PE40重组质粒在大肠杆菌表达,用HPLC半制备分离其产物,SDS-PAGE及Western-blot鉴定.IL6-PE40的细胞毒活性采用[3H]-亮氨酸掺入U266骨髓瘤细胞检测.
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P物质对人粒细胞白血病细胞HL60及小鼠T淋巴白血病细胞L615生长的抑制作用
目的:探讨SP对肿瘤细胞系HL60及L615生长的影响.方法:将SP与两株肿瘤细胞共温育,用活细胞计数和MTT试验观察细胞生长趋势,并通过电镜观察、流式细胞术分析、G蛋白活性及PKC活性测定等方法探讨该作用的分子机制,后用动物体内实验验证经SP处理后细胞的致瘤性变化.结果:10-7~10-5 mol/L SP均可抑制HL60和L615细胞生长,活细胞计数测得的抑制率分别是17.01%±5.55%(n=6, P<0.05)和17.57%±5.38%(n=5, P<0.05);MTT试验测得的抑制率分别是13.89%±5.75%(n=6, P<0.05)和13.12%±11.56%(n=8, P<0.05).电镜结果表明SP可引起L615细胞凋亡,FCM结果显示实验组比对照组凋亡增加62.49%±27.00%(n=8, P<0.05).而HL60细胞无凋亡趋势.SP可使HL60和L615细胞系的PKC活性增加,分别为18.94%±4.19%(n=5, P<0.01)和16.40%±9.37%(n=4, P<0.05).SP与百日咳毒素共作用于细胞时,可拮抗后者的抑制作用,对HL60的抑制率降为2.92%±0.20%(n=6, P>0.05),表现为与对照无差异;对L615的抑制率大幅度降低至7.42%±5.01%(n=5, P<0.05),表明SP对G蛋白有激活作用.单抗HIM70可促进HL60细胞生长,增加率为11.01%±7.56%(n=7, P<0.01),与SP共作用时可拮抗SP的抑制作用,抑制率从24.69%±11.28%降至17.17%±8.48%(n=7, P<0.01).体内实验s结果显示经SP处理后的HL60细胞可使裸鼠肿瘤潜伏期延长4 d,且瘤块增长较慢,接种第10 d对照组与实验组瘤块分别为(111.35×111.35×111.35) mm、 0,第13 d两组分别为(335.78×335.78×335.78) mm、 (143.24×143.24×143.24) mm.处理后的L615细胞使实验组的615小鼠发病率降为0,而对照组的发病率为60%.结论:SP对两株肿瘤细胞的生长有抑制作用,其抑制机制在两株细胞可能不同,且SP对两株细胞系生长的抑制作用不同于直接杀伤性的细胞毒作用,而显示了SP作为调节分子的特性.
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逆转录病毒介导的反义C-MYC的抗小鼠L6565白血病作用
目的和方法:L6565白血病是我国特有的T-S-Z淋巴瘤/白血病系统中的实验系统的瘤株之一,经检测c-myc基因高表达.本文针对c-myc基因构建一个含有小鼠反义c-myc基因片段的逆转录表达载体pGAM,用磷酸钙沉淀法将pGAM导入表达包装细胞PA317,经筛选获得病毒效价5×105 cfu/mL的病毒包装细胞,利用pGAM病毒成功的感染了L6565细胞,得到了G418抗性细胞L6565-as,经PCR分析病毒载体序列稳定地整合到PA317和L6565-as中,能够长期表达.结果:L6565-as和对照细胞光镜下形态均为圆形或椭圆形,细胞大小不一,但L6565as细胞核浆比例比对照细胞小.生长曲线和MTT法显示,L6565-as生长与对照细胞相比,生长明显受到抑制.流式细胞仪检测细胞周期:L6565as细胞G0-G1为45%,PGNsC对照和空白对照细胞分别为26%和29%.软琼脂克隆发现L6565as细胞形成克隆数量明显减少,为30个克隆/5000个细胞,空载病毒和空白对照分别为103和106个克隆/5000个细胞,二者有显著差异(P<0.001).免疫组化检测L6565as细胞c-myc蛋白表达为弱阳性(+),而对照细胞为强阳性(+++).Northern blot检测发现L6565as细胞c-myc mRNA表达比对照减少.结论:反义c-myc基因抑制了L6565白血病细胞的DNA合成,减缓了细胞的生长速度,并且使细胞恶性程度降低.本研究同时也是对我国T-S-Z系统白血病研究的一种深入.
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下调Sam68基因表达促进急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡
目的:探讨Sam68蛋白对白血病细胞Jurkat凋亡的影响。方法:针对Sam68靶点构建pLKO-Tet-On条件性真核表达干扰载体,制备慢病毒并感染Jurkat细胞,诱导干扰载体表达,筛选稳定表达shRNA细胞;采用实时荧光定量和免疫印迹技术检测干扰效率;应用流式细胞术检测细胞凋亡,采用免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白表达水平变化情况。结果:Sam68基因表达下调的细胞凋亡数量增多,伴随caspase-3活化水平增加和PARP活化水平下降,Akt磷酸化水平下降,Erk和Bcl-xL表达水平无明显变化。结论:Sam68基因表达下调可通过影响Akt信号通路影响caspase-3和PARP蛋白表达,从而促进Jurkat细胞凋亡。
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枸杞多糖对紫外线照射的RAW264.7细胞保护作用的分析
随着大气臭氧层逐渐变薄,人类接触的紫外强度不断增加,由此引起的疾病日益增多,如皮肤癌、白内障、衰老等。紫外线照射细胞后,产生各种氧自由基,通过引起脂质过氧化而损伤多种细胞膜相结构,进而引发细胞凋亡和基因的改变或突变。寻找有效的抗氧化、抗紫外线制剂十分必要。枸杞多糖是从茄科植物宁夏枸杞中提取的生物活力多糖,含有多种单糖成分,通过预处理和作用于受紫外线照射的RAW264.7细胞,分别用MTT法、中性红吞噬法和Griess法检测RAW264.7细胞的存活率、细胞的吞噬能力和NO的分泌量。结果显示紫外线可以造成体外培养的RAW264.7细胞发生氧化损伤,经枸杞多糖处理的RAW264.7细胞的存活率和吞噬能力显著提高,NO的分泌水平明显降低,提示枸杞多糖可以减轻受紫外线照射的细胞损伤程度,其作用可能与抗氧化反应有关。 RAW264.7细胞是一种小鼠单核巨噬细胞白血病细胞,具有吞饮和抗体依赖分解绵阳红血球和肿瘤细胞的能力,枸杞多糖保护RAW264.7细胞的作用是否还影响了免疫细胞的功能,有待深入探讨。实验对枸杞多糖的临床应用提供了有力的依据。
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骨髓基质细胞分泌抑制白血病细胞增殖的细胞因子
在研究骨髓基质细胞对造血调控的作用中,我们从人骨髓成纤维细胞克隆亚系(HFCL-1)条件培养液中发现新的能抑制HL-60细胞增殖的活性组分.1.采用MTT实验监测活性组分对HL-60细胞增殖的抑制能力.采用NBT还原实验和酸性磷酸酶测定观察活性组分对HL-60细胞的诱导分化能力.2.采用中空纤维柱超滤浓缩、DEAE cellulose-52、Phenyl Sepharose、chromatofocusing、Sephacryl S-100、Prep-PAGE和HPLC等程序,从HFCL-1细胞条件培养液中纯化出两组具有明显抑制HL-60细胞增殖的活性组分.一定剂量(抑制率60%~80%)下,一组对HL-60细胞有诱导分化作用;另一组无诱导分化作用.3.活性组分对正常骨髓细胞体外培养有一定抑制作用;对U937和K562白血病细胞有明显的抑制作用.4.活性组分的pI值在4~6之间,分子量在35~50 kD之间,在还原型8%~14% SDS-PAGE分析中呈2~3条主要区带.活性组分的pI值、分子量和生物学性质均有别于TNF-α、LIF和TGF-β等己知造血负调节因子,很可能是新型造血负调节因子.
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008用氟达拉滨联合Ara-C和G-CSF治疗高危MDS和老年AML患者的疗效评价
阿糖胞苷(Ara-C)是治疗髓性恶性肿瘤的有效的药物之一.急性白血病患者在完全缓解后使用大剂量Ara-C能够减少复发,并且获得更好的无病生存.然而对于老年白血病患者(年龄60岁以上),由于毒副作用的增加,使用大剂量Ara-C就不能达到上述疗效.Ara-C的临床作用依赖于在体内转化为活性代谢产物Ara-C-5'-triphosphate(Ara-CTP),后者随后被吸收入DNA,从而导致白血病细胞的死亡.有研究表明氟达拉滨在体外和体内均能增加Ara-CTP的产生.在此基础上,FLAG方案即氟达拉滨,Ara-C,粒细胞集落刺激因子(G-CSF)开始应用于临床.本文旨在对此方案的治疗效果作一评估.
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Bcl-2反义寡核苷酸增强阿糖胞苷诱导原代白血病细胞凋亡的研究
背景与目的:有研究证实,针对bcl-2mRNA翻译起始区和蛋白编码区的2个有效反义作用靶点的反义寡核苷酸能增强HL-60和K562细胞对阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素、足叶乙甙的敏感性.本研究观察这两个新靶点的反义寡核苷酸对Ara-C诱导原代培养的急性白血病(AL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞凋亡的影响.方法:用细胞记数法观察细胞的生存情况;免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测细胞Bcl-2蛋白水平;用姬姆萨染色法观察并用流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:靶向bcl-2mRNA翻译起始区与靶向蛋白编码区的两个反义寡核苷酸分别与Ara-C联合作用AL、CLL细胞48h,细胞的活性受到明显的抑制,分别同无关寡核苷酸(NS-ODN)联合Ara-C组、单用Ara-C组进行比较,差异有显著性(P<0.05).这两个不同靶点的反义寡核苷酸分别与Ara-C联用均能明显下调AL、CLL细胞Bcl-2蛋白的表达,并且联合作用AL、CLL细胞48h的凋亡细胞百分率分别与NS-ODN联合Ara-C组、单用Ara-C组进行比较,差异有显著性(P<0.05).与靶向bcl-2mRNA翻译起始区的反义寡核苷酸比较,靶向蛋白编码区的反义寡核苷酸提高AL细胞对Ara-C的敏感性作用要强些(P<0.05).结论:针对bcl-2mRNA翻译起始区和蛋白编码区两个靶点的反义寡核苷酸能增强Ara-C诱导AL、CLL细胞的凋亡.
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真核细胞表达的重组蛋白VEGF-C对白血病细胞增殖与凋亡的影响
背景与目的:VEGF-C/VEGFR-2,3信号通路可诱导血管/淋巴管新生,促进实体肿瘤浸润和转移.近年来研究表明VEGF-C及其受体也在血液肿瘤细胞中表达,但其对白血病细胞的作用尚不清楚.本文拟探讨转染VEGF-C的CHO细胞(CHO/VEGF-C细胞)分泌的重组蛋白VEGF-C对VEGFR-3+白血病细胞的增殖及化疗药物诱导的凋亡的影响.方法:利用鸡胚绒毛尿囊膜观察CHO/VEGF-C细胞培养上清中重组VEGF-C诱导血管新生的作用.用RT-PCR和流式细胞术检测血液肿瘤细胞株中VEGF-C受体表达水平.采用噻唑蓝(MTT)法检测VEGF-C对白血病细胞株(NB4及K562)增殖的影响;Annexin V/PI双染流式细胞术检测凋亡细胞以观察VEGF-C对化疗药物(Etoposide,DNR,AS2O3)诱导的VEGFR-3+阳性白血病细胞株的凋亡的作用.结果:CHO/VEGF-C细胞上清中的重组蛋白VEGF-C可以诱导鸡胚绒毛尿囊膜的血管新生.9例血液肿瘤细胞株中,NB4、HEL和RPMI8226表达VEGFR-3,HEL和TF-1表达VEGFR-2.与对照组(CHO/pcDNA3.1细胞上清)相比,重组蛋白VEGF-C可以促进VEGFR-3+白血病细胞NB4增殖(P24h=0.006,P48h=0.018),而对VEGRR-3-白血病细胞K562则没有明显作用;重组蛋白VEGF-C还具有抑制化疗药物(Etoposide、DNR、As2O3)诱导的NB4细胞凋亡的作用(P=0.019,0.013,0.042).结论:重组蛋白VEGF-C不仅可诱导血管新生,而且可能通过VEGFR-3信号途径促进白血病细胞增殖及抗凋亡;推测VEGF-C/VEGFR-3信号途径可望作为白血病治疗的靶点.
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干细胞因子mRNA在原代白血病细胞的表达
目的观察白血病原代细胞中干细胞因子(SCF)mRNA的表达情况并探讨其与预后的关系.方法以巢式逆转录多聚酶链反应检测了49例(两种类型)白血病患者骨髓原代白血病细胞中SCFmRNA的表达情况.结果在19例急性淋巴细胞白血病(ALL)中,SCF mRNA 5例阳性、14例阴性;30例急性髓性白血病(AML)中,24例M1~M4亚型者表达SCFmRNA,4例M5及2例M6为阴性.两组间有显著差异(P<0.05).在29例SCF阳性者中,8例(27.6%)属难治性白血病;在20例SCF阴性者中,12例(60.0%)为难治性白血病(P<0.05).结论AML组的SCF表达率显著高于ALL;SCF阴性提示患者预后较差,其确切机制有待进一步研究.
关键词: 干细胞因子 白血病细胞 巢式逆转录聚合酶链反应 -
微波联合化疗对白血病耐药细胞株K562/MDR的作用
目的:研究微波联合化疗药物对白血病耐药细胞株K562/MDR的抑制作用. 方法:用四唑蓝快速比色法(MTT法)检测细胞存活率. 结果:吡柔比星(THP)经20 min 43 ℃水浴加热处理,对K562/MDR的抑制作用明显提高(P<0.05),再联合微波对吡柔比星抑制作用的提高不明显.长春新碱(VCR)经20 min 43 ℃水浴加热处理,对K562/MDR的抑制作用提高不明显,但联合微波后,长春新碱的抑制作用明显提高(P<0.05). 结论:微波与高温能增加K562/MDR细胞对化疗药物的敏感性.
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白血病细胞对三氧化二砷的不同敏感性
目的:探索白血病细胞对三氧化二砷(As2O3)敏感性的差异.方法:用台盼蓝染色区分死活细胞,检测细胞活性;利用碘化丙啶(PI)染色和流式细胞技术测定凋亡细胞和细胞DNA的含量.结果:0.50μmol/L以上浓度的As2O3与细胞共同孵育48h以后对NB4细胞有明显的杀伤作用;而对K562细胞来说,As2O3浓度要达到2.0μmol/L以上,72 h以后才有明显的杀伤作用.结论:白血病细胞对As2O3有不同的敏感性.
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bcl-2基因反义核酸对 HL-60和K 562白血病细胞生存的影响
目的:探索bcl-2基因反义核酸对白血病细胞生存的影响.方法:主要应用细胞培养和细胞克隆的方法,检测了bcl-2基因反义核酸对HL-60和K562白血病细胞系生存的影响.结果:bcl-2基因反义核酸浓度在2~8 μmol/L和6~12 μmol/L分别对HL-60和K562细胞的生存有明显的抑制效应,呈剂量-效应关系,二者起效应时间均为第3 d;bcl-2基因反义核酸浓度为4μmol/L时,对HL-60和K562细胞集落形成都有明显抑制效应.结论:bcl-2基因反义核酸对白血病细胞生存有明显的影响.
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中药厚朴提取物对人白血病细胞作用初探
目的:研究中药厚朴提取物和厚朴酚与厚朴酚对白血病细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用.方法:用MTT、AnnexinV、凋亡DNA Ladder等实验,观察和厚朴酚与厚朴酚对白血病K562、HL-60和U937细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用.结果:和厚朴酚实验组对K562、HL-60和U937有增殖抑制作用,呈剂量-时间依赖性,且对K562、HL-60和U937有诱导凋亡作用;厚朴酚对HL-60有增殖抑制作用,并呈剂量-时间依赖性,但与和厚朴酚联合用药无协同作用.结论:和厚朴酚与厚朴酚对白血病细胞株均有增殖抑制作用,且呈剂量-时间依赖性,但二者之间无联合协同作用.
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眼镜蛇毒C组分对白血病细胞中基质金属蛋白酶-2、9表达的影响
目的 探讨眼镜蛇毒C组分对白血病细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表达和活性的影响.方法 用10 ng/mL的眼镜蛇毒C组分对白血病细胞进行0、12、24、48 h处理.用ELISA、明胶酶谱法和荧光RT-PCR法检测不同时间处理后白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达水平.结果 与处理0h相比,白血病细胞经10 ng/mL的眼镜蛇毒C组分分别处理12、24、48 h后,用ELISA检测结果显示MMP-2、MMP-9活性下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);明胶酶谱法检测结果显示MMP-2、MMP-9活性下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);荧光定量RT-PCR检测结果显示,MMP-2、MMP-9 mRNA相对含量下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01).结论 10 ng/mL眼镜蛇毒C组分对白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达均有抑制作用,眼镜蛇毒C组分对白血病细胞的抑制作用可能与其抑制MMP-2和MMP-9表达和活性相关.
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微波对白血病耐药细胞株K562/MDR的影响
目的研究微波对白血病耐药细胞株K562/MDR耐药性的影响.方法使用流式细胞仪测量K562/MDR细胞内罗丹明(Rh123)含量及多药耐药基因产物P-糖蛋白(P-gp)的表达,使用DPH标记的荧光分光光度计法测量K562/MDR细胞膜流动性.结果微波处理后,K562/MDR细胞内罗丹明含量增加,P-gp糖蛋白表达下降,细胞膜流动性增加.结论微波能对白血病耐药细胞株K562/MDR的耐药性起一定的逆转作用.
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双表型急性白血病的MIC分型研究
双表型急性白血病是急性混合性白血病(HAL)的其中一类,指的是病人骨髓的同一白血病细胞同时表达淋巴系和髓系特征[1].我院1997年诊断成人和儿童急性白血病52例,全部进行MIC分型,其中15例为双表型急性白血病,占总数的28%.
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在肿瘤干细胞中的研究进展
Bmi1是荷兰癌症中心于1991年在转基因鼠感染Moloney鼠白血病病毒过程中通过逆转录病毒插入突变发现的[1],1993年,ALKEMA等[2]首次将其从人白血病细胞中分离出来.作为多梳基因家族成员之一,Bmi1在细胞的增殖和干细胞自我更新、分化调节中发挥重要作用[3-4].目前,已有多项研究报道Bmi1在多种肿瘤如白血病、乳腺癌、肺癌、胃癌等中高表达[5-7],并且与肿瘤的转移和扩散相关.传统的肿瘤治疗方法是利用手术、放化疗等方法尽量清除已存在的肿瘤细胞,但术后仍有复发和转移,近年来肿瘤干细胞理论的提出,为恶性肿瘤的根治提供了新的思路[8].