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人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测
目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.
关键词： 人乳头瘤病毒(HPV) 热休克蛋白 HSC70 E7 融合蛋白 -
电针对帕金森病模型大鼠脑黑质内Lamp2a、Hsc70、α-syn表达的影响
目的:观察电针对鱼藤酮诱导的帕金森病(Parkinson's disease,PD)模型大鼠脑黑质内Lamp2a、Hsc70、α-syn表达的影响,探讨电针治疗帕金森病的可能作用机制.方法:雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针治疗组,每组15只.采取颈背部皮下注射鱼藤酮法制备帕金森病模型,假手术组只注射不合鱼藤酮的等量葵花油乳化液.正常组、假手术组、模型组不进行任何治疗;电针治疗组在造模完成后取穴“风府”、“太冲”,连续波,频率120次/min,每次治疗20 min,每天1次,疗程为28 d.免疫组化法检测模型大鼠黑质内TH、α-syn的阳性表达,并用Western blot法检测模型大鼠黑质内Lamp2a、Hse70、α-syn的表达.结果:模型组大鼠表现出明显的PD症候群特征,电针干预后模型大鼠行为学评分明显降低(P＜0.01);免疫组化法及West-ernblot检测显示电针治疗通过上调Lamp2A、Hsc70水平能抑制错误折叠蛋白α-syn的表达,提高TH的阳性表达.结论:电针可以抑制具有细胞毒性作用的α-syn的集聚,保护多巴胺能神经元,抑制帕金森病的发展,其机制可能与干预分子伴侣介导的自噬有关.
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肿瘤相关抗原HSC70在食管癌中的鉴定与表达研究
目的 探索食管鳞状细胞癌的肿瘤相关抗原.方法 提取食管鳞状细胞癌组织蛋白,用20例食管癌患者血清和20例健康对照血清分别作为检测抗体进行Western blot分析,比较分析二者的差异,将差异蛋白酶解后用质谱进行鉴定分析;用免疫组化方法对鉴定的肿瘤相关抗原进行验证.结果 食管癌血清的阳性信号比较多,其中70kDa的蛋白阳性率为40%(8/20),而健康对照血清阳性率为0%(0/20),该蛋白被鉴定为HSC70或称HSPA8.免疫组化结果显示HSC70在食管癌组织主要表达于细胞浆和细胞核,且表达明显高于癌旁正常组织.结论 联合免疫印记和质谱技术可以鉴定肿瘤相关抗原;HSC70可能是食管癌发生的重要参与蛋白,可能是食管癌诊断和治疗的关键靶分子.
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反义HSC70与mtP53和肿瘤耐药关系的探讨
目的观察反义HSC 70 RNA对MCF7/Adr人乳腺癌细胞耐药性影响,探讨其与突变型p53稳定性和肿瘤耐药间的关系.方法利用DNA重组技术将人HSC70 cDNA片段反向克隆至真核表达载体pLXSN中,构建反义人HSC70真核表达质粒pX-AHSC70.用脂质体方法将重组质粒转染至MCF7/Adr人乳腺癌细胞内,以PCR确定转染细胞中外源DNA存在后,Western blot检测HSC70蛋白的抑制程度.MTT法检测细胞耐药性的影响.p53稳定性实验分析反义HSC70 RNA对突变型p53半衰期的改变.结果经G418筛选获得稳定表达反义HSC70 RNA的细胞株MAc70,与空载体MAX细胞相比,HSC70蛋白表达下降42%,细胞耐药性显著下降.p53稳定性实验表明,其胞内突变型p53含量下降,半衰期缩短,稳定性明显下降.结论反义HSC70 RNA能够明显降低HSC70蛋白表达,导致乳腺癌细胞的耐药性下降,提示HSC70可能通过增强突变型p53稳定性的途径而参与MCF7/Adr乳腺癌细胞的耐药.
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热休克蛋白70家族的功能和在神经保护中的作用
脑缺血耐受的实验研究发现，诱导热休克蛋白70家族(HSP70)的表达增加可能是内源性脑保护机制之一。HSP70包括两种蛋白：Hsp70(诱导型)和Hsc70(结构型)。本文就这两种蛋白的功能、表达的调节及在不同应激反应中表达的相关性作一综述。
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人HSC70基因真核表达载体的构建和表达
目的 构建HSC70(HSC)真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达.方法 采用KT-RCR方法 从正常人肝细胞系QZE中得到HSC70的CDNA序列,然后,克隆入pcDNATM3.1/V5-HisA载体,构建重组质粒pcDNA-HSC70;经酶切和测序鉴定后,将pcDNA-HSC70体外转染HepG2细胞系,瞬时表达带有His标签的HSC70融合蛋白;并通过免疫细胞化学方法 检测蛋白表达情况.结果 RT-PCR扩增到1960 bp的HSC70cDNA片断,经测序分析与GenBank中已知序列一致;重组质粒pcDNA-HSC70转染后的HepG2细胞中,可检测到瞬时表达的HSC70-His融合蛋白.结论 成功构建重组质粒pcDNA-HSC70,并可以在真核细胞HepG2中瞬时表述.
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应用小肽融合蛋白免疫诱导抗HER-2体液免疫反应
目的 应用HER-2B细胞表位模拟小肽Mut与Hsc70的融合蛋白诱导抗小肽和抗HER-2的体液免疫反应.方法 将Hsc70和Mut小肽序列定向插入pQE40载体中,构建pQE40-Hsc70-Mut原核表达质粒,并诱导表达、纯化融合蛋白Hsc70-Mut.常规免疫Balb/c小鼠,应用ELISA、Westem blot检测小鼠血清中抗小肽Mut和抗HER-2的体液免疫反应.结果 成功构建了pQE40-Hsc70-Mut原核表达质粒,Hsc70-Mut融合蛋白在大肠杆菌SG13009能够实现可溶件表达,应用Ni-NTA纯化可得到纯度>90%的融合蛋白;Hsc70-Mut免疫小鼠可产生抗Mut小肽的免疫反应,部分小鼠同时可产生抗HER-2的体液免疫反应.结论 Hsc70-Mut融合蛋门免疫小鼠可产生抗小肽和抗HER-2的体液免疫反应,为HER-2疫苗的研制奠定了一定基础,同时应用小肽融合蛋白免疫也为小肽免疫提供了一种新的免疫策略.
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抗乙肝病毒靶点研究新进展
慢性乙型肝炎是严重威胁人类的一种慢性感染性疾病,目前,虽然临床上对乙肝的治疗有一定的进展,但临床上存在的因病毒变异而导致的耐药问题,仍无法解决,大大限制了抗病毒药物的使用,对治疗带来一定的困难,因此研究新的抗病毒靶点对今后抗病毒治疗有很大意义.本文着重介绍了新抗病毒靶点的研究进展.
