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精浆内脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶与α-葡萄糖苷酶的相关性研究
目的分析脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(L-PGDS)与精浆其他参数之间的关系,探讨L-PGDS在男性生殖系统中的作用.方法分析92份精液中的精子密度、精子活力、L-PGDS浓度、酸性磷酸酶活力以及α-葡萄糖苷酶活力.依据精子密度,将标本分为3组:正常组(精子密度＞20×106/ml)、寡精子组(精子密度＜20×106/ml)及无精子组(精子密度为0).彩色精子质量分析系统测定精子密度及活力,双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测精浆内的L-PGDS浓度,分光光度计测定α-葡萄糖苷酶活力.结果正常组、寡精子组以及无精子组患者精浆L-PGDS浓度依次降低,差异显著(P＜0.001).L-PGDS的浓度与α-葡萄糖苷酶、精子密度及精子活力呈正相关,相关系数(r)分别为0.426、0.813和0.380.结论精浆L-PGDS浓度可作为少精子症的辅助诊断指标.
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抗前列腺素D合成酶自身抗体酶联免疫吸附试验检测方法的建立及其在不育症诊断中的初步应用
目的:证实抗lipocalin型前列腺素D合成酶(L-PGDS)自身抗体的存在,建立检测该抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,并探讨其在不育症诊断中的初步应用.方法:用纯化的重组L-PGDS作为抗原,建立检测抗L-PGDS自身抗体的ELISA法,并用特异性L-PGDS吸附试验检测ELISA法的特异性,同时检测ELISA法的重复性,并对204例不育症病人的精浆和血清中抗L-PGDS自身抗体进行检测.结果:特异性吸附试验和重复性试验证实,ELISA法稳定可靠,114例不育男性中精浆抗L-PGDS自身抗体阳性者49例(34.0%);无精子症、少精子症病人的阳性率(48.5%和43.2%)明显高于正常精子数的不育男性(23.0%)(P<0.01和P<0.05).60例不育病人血清抗L-PGDS自身抗体阳性18例(30.0%).结论:不育症病人精浆和血清中存在抗L-PGDS自身抗体,建立的ELISA法稳定可靠,适用于临床大批量标本检测.
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小鼠早孕期子宫中脂质运载蛋白前列腺素D合成酶和前列腺素D受体的表达
目的检测脑型脂质运载蛋白前列腺素D合成酶(LPGDS)和前列腺素D受体(DP)在早孕期小鼠子宫中的表达变化,评价LPGDS和DP在胚胎着床和妊娠维持中的作用. 方法用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测LPGDS和DP在孕1～8 d小鼠子宫中的表达水平,以及在胚胎着床和非着床位点(妊娠第5天)的表达. 结果小鼠孕2～4 d,LPGDS mRNA 的水平明显高于孕1、5～8 d;孕5～8 d,DP mRNA的水平显著高于孕1～4 d.孕第5天,胚胎着床和非着床位点LPGDS的表达没有差异,DP在胚胎非着床位点的表达显著高于着床位点. 结论 LPGDS在小鼠胚胎着床前子宫中高表达,DP在胚胎着床后高表达; 说明LPGDS可能与子宫发育成为可接受态有关,而DP作用在于维持妊娠.
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人Lipocalin型前列腺素D合成酶真核载体的构建及酵母表达菌株的建立
目的:在毕赤酵母中表达人睾丸Lipocalin型前列腺素D合成酶(L-PGDS),以利于生物学功能及临床应用研究.方法:用PCR的方法从质粒pGEX-2T/htL-PGDS上扩增出人睾丸L-PGDS基因编码序列,构建该基因的酵母表达质粒;将表达质粒电转化毕赤酵母,甲醇诱导L-PGDS的表达.结果:PCR扩增的L-PGDS成熟肽基因编码序列克隆T载体后,经测序证明与所报道的人睾丸L-PGDS cDNA完全一致.对培养上清进行SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量为27000处有重组蛋白的表达,与理论值完全一致.结论:人Lipocalin型前列腺素D合成酶在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.
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重组人睾丸前列腺素D合成酶DNA免疫鸡的初步研究
目的: 证实用重组人睾丸前列腺素D合成酶(rhtL-PGDS) DNA免疫鸡可获得相应的抗体. 方法: 用重组质粒pGEX-2T/htL-PGDS DNA(100 μg)免疫鸡,隔2周加强1次,共2次.抽取鸡血分离血清,以原核表达的rhtL-PGDS作为抗原,琼脂糖双向免疫扩散法和ELISA法检测鸡血清中有无抗L-PGDS抗体及其效价. 结果: 琼脂糖双向免疫扩散法证实鸡血清中存在抗L-PGDS抗体,ELISA法检出其效价为1∶ 2 048. 结论: 用重组质粒pGEX-2T/htL-PGDS DNA免疫鸡制备抗L-PGDS抗体是可行的 .
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PGDS 和 PGES 在增生性瘢痕中的表达
目的 研究前列腺素D合成酶(PGDS)和前列腺素E合成酶(PGES)在增生性瘢痕组织中的表达.方法 根据瘢痕形成时间 ,将47例患者分为烧伤早期组(A1组 ,9例)以及瘢痕形成后1个月(A2组 ,9例)、3个月(A3组 ,9例)、6个月(A4组 ,8例)、12个月(A5组 ,6例)和24个月组(A6组 ,6例);另设正常皮肤组织的对照组(B组 ,10例).采用Western blot和免疫组化染色法检测各组PGDS、PGES蛋白表达.结果 与B组相比 ,A1、A2、A3、A4、A5组PGDS和PGES蛋白表达及阳性表达率均升高(P<0 .05) ,并随着瘢痕形成时间的增加而逐渐降低 ;A6组PGDS和 PGES蛋白表达及阳性表达率与B组比较无统计学差异(P>0 .05).结论 前列腺素可能是与增生性瘢痕形成有关的重要介质.
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人睾丸前列腺素D合成酶的原核表达
目的:将获得纯化的重组人睾丸前列腺素D合成酶(L -PGDS)用于基础和临床研究. 方法:在原核表达系统中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒pGEX -2T/htL -PGDS的表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠亲和并纯化重组融合蛋白GST/htL -PGDS,再用凝血酶裂解融合蛋白,从而获得纯化的重组L -PGDS.对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序,并对重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)分析,鉴定其是否为所需目的蛋白. 结果:用IPTG诱导重组质粒pGEX -2T/htL -PGDS表达的佳浓度为1 mmol/L,佳时间为4 h.在此基础上获得的融合蛋白用凝血酶裂解后获得单一纯化的重组蛋白L -PGDS,佳裂解时间为2 h.SDS -PAGE和DNA测序证实,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白. 结论:用上述方法可获得纯化的人睾丸L-PGDS.
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可溶性重组人睾丸前列腺素D合成酶的原核表达及活性鉴定
目的得到纯化的、可溶性的、且有活性的重组人睾丸前列腺素D合成酶(rhtL-PGDS).方法通过降温诱导重组质粒pGEX-2T/htL-PGDS表达,获得了可溶性重组融合蛋白.用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化和凝血酶酶切重组融合蛋白制备纯化的rhtL-PGDS.根据L-PGDS与视黄酸结合后发生波谱红移鉴定其活性.结果诱导温度从37℃降至15℃,重组融合蛋白以可溶性形式表达.通过凝血酶酶切和谷胱甘肽琼脂糖珠纯化获得了纯化的rhtL-PGDS.rhtL-PGDS与视黄酸结合后波谱从342nm迁移至374nm,证实rhtL-PGDS具有生物学活性.结论降温诱导重组质粒pGEX-2T/htL-PGDS可避免包涵体形成,获得可溶性的具有生物学活性的rhtL-PGDS.
