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质粒转染对HEK293和DDT1-MF2细胞天然β2-肾上腺素受体表达的影响
目的:观察质粒转染对细胞天然β2-肾上腺素受体(β2-AR)表达量的影响.方法 :将不携带外源目的基因的pREP4质粒和携带α1B-AR或β1-AR cDNA的p REP4质粒,采用脂质体和磷酸钙沉淀法转染HEK293和DDT1-MF2细胞.结果:相同质粒载体,无论有无外源目的基因 ,或目的基因是否相同,均可使HEK293细胞天然表达的β2-AR密度及其介导的cAMP蓄积效应增加.而用同样方法在DDT1-MF2细胞转染pREP4质粒则对β2-AR表达无影响. 结论:转染携带或不携带目的基因的质粒对HEK293细胞天然表达β2-AR的密度及其介导的功能效应均有影响,且提示这种效应可能具有细胞特异性.
关键词： 质粒/遗传学 转染 受体 肾上腺素能β-2/代谢 -
小鼠内皮抑素基因克隆、测序及pEgr-IFNγ-mEndostatin 重组双基因表达质粒的构建
目的:克隆小鼠内皮抑素(mEndostatin)编码区cDNA序列并构建含Egr-1启动子的IFNγ和mEndostatin双基因表达载体.方法:利用逆转录多聚酶链反应法(RT-PCR),以小鼠肝细胞mRNA为模板,扩增获得全长mEndostatin,与pMD18T载体连接作全自动测序,并利用基因重组技术构建含Egr-1启动子的IFNγ和mEndostatin双基因表达质粒.结果:经测序证实获得的mEndostatin序列与文献报道完全一致,并构建了含Egr-1启动子的IFNγ和mEndostatin双基因表达质粒pEgr-IFNγ-mEndostatin.结论:利用RT-PCR法成功克隆了mEndostatin的cDNA序列,构建了pEgr-IFNγ-mEndostatin重组双基因表达质粒.
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人TIMP-2基因真核表达质粒的构建及其表达研究
目的构建人TIMP-2基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达.方法利用RT-PCR方法获得人TIMP-2基因cDNA,以pcDNA3为载体构建真核表达质粒pcDNA3/TIMP-2,采用脂质体介导基因转染技术将重组质粒DNA导入CHO细胞中,加入G418对转染细胞进行筛选获得稳定转染细胞,采用Western blot对重组质粒的表达进行检测.结果酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3/TIMP-2构建正确,在转化细胞中检测到人TIMP-2的表达.结论成功构建人TIMP-2真核表达质粒并获得稳定表达人TIMP-2的CHO细胞株.
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抗HIF-1α和survivin基因双靶位miR-RNAi载体的构建及其对胰腺癌细胞的作用
目的:构建抗HIF-1α单靶位(anti-H)、抗Survivin单靶位(anti-S)以及抗HIF-1α和Survivin基因双靶位微小RNA表达载体(anti-H+S),观察和比较这3种载体对胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响.方法:设计4组靶向HIF-1α和Survivin基因的寡核苷酸序列,连接至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒,构建两组共8个载体,依次为anti-H(Ⅰ)、anti-H(Ⅱ)、anti-H(Ⅲ)、anti-H(Ⅳ)和anti-S(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)、anti-S(Ⅲ)、anti-S(Ⅳ).实时定量RT-PCR检测靶基因mRNA的表达水平,将两组中mRNA下调作用强的质粒串联,构建anti-H+S.用anti-H+S及mRNA下调作用强的anti-H和anti-S转染胰腺癌Panc-1细胞,Western blot测定靶蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖活性.结果:经测序鉴定,所有anti-H、anti-S及双靶位质粒anti-H+S装载位点核苷酸序列与设计序列完全相符.anti-H的靶基因mRNA沉默效率依次为48％、2％、44％和30％；anti-S的靶基因mRNA沉默效率依次为72％、75％、58％和59％.由anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ)串联得到双靶位质粒anti-H+S.anti-H+S的靶基因mRNA沉默效率为53％ (HIF-1α)和42％(survivin).anti-H(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)及anti-H+S与对照质粒相比均使靶基因蛋白的表达明显下降,细胞增殖受到明显抑制(P＜0.05).其中anti-H+S对细胞的增殖抑制作用强于anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ),72h后差异有统计学意义(P＜0.05).结论:本研究成功构建了抗HIF-1α和Survivin的单靶位质粒和双靶位质粒；其中,anti-H+S抑制胰腺癌Panc-1细胞增殖作用强于anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ).
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野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱
目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况.方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、Xba Ⅰ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定；将pCS2+ -hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针.用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交.结果:构建和鉴定了pCS2+ -hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达.结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达.
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日本血吸虫Sj-Ts4样蛋白基因的克隆、表达和初步鉴定
目的 为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Ts4样融合蛋白.方法 提取日本血吸虫成虫RNA,设计引物,用RT-PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Ts4样蛋白基因编码序列,T载体连接,将其亚克隆入PGEX-5X-1载体中,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌DH5α并用IPTG对该重组菌诱导表达,SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果.结果 RT-PCR法扩增出一条大小约为870 bp的片段,表达质粒PGEX-5X-1-SjTs4经双酶切和以该重组质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约58 ku大小的GST融合蛋白条带,并可与抗GST特异性抗体反应.结论 本实验成功地克隆了日本血吸虫Sj-Ts4样抗原的编码基因,并在原核细胞中进行表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础.
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人表面活性物质蛋白B基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒的构建及活性检测
目的 构建人表面活性物质蛋白-B (SP-B)基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒,并分析其在H441细胞中的转录活性.方法 (1)以人基因组DNA为模板,PCR扩增SP-B启动子(-218/+435 bp)序列片段,并通过TA克隆方法连接到pGM-T载体上,筛选阳性克隆将目的片段进行测序.测序鉴定正确后的目的片段被克隆到荧光素酶表达载体pGL3-Basic上构建pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒,酶切及测序鉴定重组质粒；(2)将构建的pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒酶切改造,SP-B启动子克隆进pGL4.17载体构建pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒；经酶切及基因测序确认无误后,采用脂质体法将构建的两种重组质粒分别和内参质粒pRL-TK同时转染H441细胞,检测双荧光素酶活性.结果 构建的重组质粒经酶切及测序鉴定完全正确,转染H441细胞后,检测细胞裂解液萤火虫荧光素酶(firefly)及海肾荧光素酶(renilla)活性,两者比值间接反映启动子活性,pGL3-basic/pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒的firefly/renilla比值(2.8±1.1、66.5±3.8)较空载体质粒pGL3-basic、pGL4.17(0.2±0.1,4.3±0.4)均明显升高(t=4.182,27.419,P=0.000).pGL4.17重组质粒firefly/renilla比值明显高于pGL3-basic重组质粒,其差异有统计学意义(t=27.712,P=0.000).结论 成功构建具有SP-B基因转录活性的pGL3-basic/pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒,pGL4.17重组质粒荧光素酶活性高,为后续研究SP-B基因转录调控奠定了理论基础.
