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爪蟾卵母细胞表达hERG1b钾通道的电生理学特性研究
目的 建立人类ether-a-go-go 相关基因1b(human ether-a-go-go-related gene 1b,hERG1b)钾通道在爪蟾卵母细胞上的异源性表达方法和hERG1b钾通道电流记录方法,研究hERG1b钾通道的电生理学特性.方法 将编码hERG1b亚基的cRNA注入爪蟾卵母细胞中表达hERG1b钾通道,使用双电极电压钳技术记录全细胞电流,分析hERG1b钾通道电流门控动力学特征和电生理特性.结果 与结论利用双电极电压钳技术,记录到hERG1b钾电流,该电流具有内向整流特性,胞外钾离子浓度升高可增大hERG1b钾通道电流幅度.与hERG1a钾通道电流相比,hERG1b钾通道电流的去激活速度明显加快,表现出快速去激活的电生理特征.
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爪蟾卵母细胞双电极电压钳记录技术及其内源性外向电流的研究
目的:建立爪蟾卵母细胞双电极电压钳记录技术.方法:在去除滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞上,建立双电极电压钳记录技术,并使用该技术观察爪蟾卵母细胞表达的内源性递质门控性和电压门控性离子通道电流.结果:灌流液中分别加入NMDA受体、γ-氨基丁酸和烟碱受体激动剂,均未能在爪蟾卵母细胞上诱发出电流.去极化刺激仅可诱发出一外向电流.此电流的幅度随细胞外液中Ca2+浓度的增加而增大.当外液中无Ca2+或无Cl-时,电流消失.此电流不被TEA所阻断,但能被MnCl2可逆性阻断.结论:成功建立了爪蟾卵母细胞双电极电压钳记录技术.去极化刺激在爪蟾卵母细胞上诱发出的外向电流为钙依赖性Cl-电流.
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双孔钾离子通道TREK-1功能性串联二聚体载体的构建
目的：探讨在双孔钾离子通道（K2P）TREK-1（TWIK related K ＋ channel 1）分子间加入柔性 linker 构建串联二聚体载体的可行性。方法利用 PCR 技术在两个单体 TREK-1分子之间加入一个 linker，构建串联二聚体载体（pGH19-tdTREK-1）。将上述载体体外转录成 cRNA 并显微注射至爪蟾卵母细胞，培养24～48 h 后采用双电极电压钳技术记录电流。观察胞外钡离子和不同 pH 值外液对该串联二聚体通道表达的影响，并与天然二聚体通道的反应相比较。结果串联二聚体 TdTREK-1可在爪蟾卵母细胞中高效表达，该通道形成的电流可被胞外钡离子抑制，也可被胞外液酸化所抑制，而该串联二聚体通道对这些胞外刺激因素的反应程度与天然二聚体相似。结论人为加入柔性 linker 序列构建串联二聚体 TREK-1通道并不影响通道的表达及门控特性，证明该实验方案可行。这将为操作单个亚基，进而深入研究 TREK-1的结构与功能打下良好的基础。
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α3(S147T)*乙酰胆碱受体突变型功能模型的建立
目的 构建包含α3亚基的烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)点突变型,优化受体突变的方法,并利用nAChRs的激动剂乙酰胆碱(acetycholine,ACh)对突变型的功能进行研究.方法 利用聚合酶链反应(PCR)介导的定点突变技术,设计引物并以大鼠nAChRsd3亚基的基因作为模版,获得α3亚基基因的点突变体,通过体外转录获得α3亚基突变体的cRNA.利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统和双电极电压钳技术,对含有α3亚基点突变的2种受体亚型的表达情况进行检测.同时利用ACh对受体突变型的门控特性进行检测.结果 成功建立了α3亚基第147位丝氨酸(serine,Ser,S)的突变体模型,激动剂ACh对野生型α3β2 nAChR和α3β4 nAChR的半数有效浓度(EC50)分别为55.33和163.00 μmol·L-1,对突变型α3(S147T) β2 nAChR、α3 (S147T) β4 nAChR的EC50分别为33.10和121.10 μmol·L-1.结论 将α3亚基第147位Ser突变成苏氨酸(threonine,Thr,T)后,成功建立了2个具有功能型的突变体.α3亚基点突变受体模型的成功建立,可为研究药物与α3* nAChR相互作用的分子机制提供功能模型和研究基础,也可为更多受体突变型的建立提供方法借鉴.
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利用双电极电压钳检测rs12899798单核苷酸多态性对α7烟碱受体功能的影响
目的 检测α7烟碱受体(α7 nicotinic receptor,nAChR)的一个错义突变(W55G)对受体功能的影响.方法 利用双电极电压钳在非洲爪蟾卵母细胞检测了突变体W55G的功能.首先将nAChRα7亚基的cDNA克隆进入pGEMHE载体中,利用定点突变的方法构建突变体W55G.然后在体外利用T7 RNA聚合酶合成cRNA,并利用显微注射的方法将cRNA注射进入非洲爪蟾卵母细胞中.1～3d后,利用双电极电压钳检测野生型nAChRα7及其突变体W55G的功能.结果 W55G突变体对乙酰胆碱敏感性降低约6倍,但大电流(Imax)则显著增加;对胆碱的敏感性降低了约3倍.此外,W55G突变体明显比野生nAChR有更高的时间常数,明显降低了α7烟碱受体的脱敏速率.结论 nAChRα7突变体功能的改变可能重塑突触后反应,对于脑疾病的发生可能会有较大影响.
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钩藤碱对human ether-a-go-go相关基因通道的抑制作用
将human ether-a-go-go相关基因(HERG)cRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞,采用双电极电压钳技术,观察钩藤碱对表达电流的影响.结果显示:(1)钩藤碱抑制HERG通道的表达是浓度依赖性的,IC50为(773.4±42.5)μmol/L.(2)钩藤碱抑制HERG通道的表达是电压依赖性的,大抑制率在-20 mV,为15%.上述结果提示,钩藤碱抑制HERG编码的钾通道,导致心室复极时间延长,揭示了与钩藤碱相关的心肌钾通道的分子生物学基础.
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α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达
建立以哺乳动物α3β4乙酰胆碱受体(nAChR)为分子靶标的药物筛选模型.将大鼠乙酰胆碱受体的α3与β4亚基基因分别进行体外转录,获得α3与β4亚基基因的cRNA,按1:1的比例将适量α3与β4的cRNA 混合后,显微注射到新鲜分离的非洲爪蟾卵母细胞中,在ND96溶液中、17℃下培养24 h后,通过双电极电压钳技术(TEVC)检测受体α3β4nAChR的乙酰胆碱(Ach)门控电流.同时注入α3、β4cRNA的非洲爪蟾卵母细胞孵育24h后,可记录到明显的Ach门控内向电流,未注射或只注射ddH2O的对照组细胞则没有任何电流产生.α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达,以此为药物作用靶点,可用于大量生物毒素等物质的活性筛选实验模型.
关键词： α3β4乙酰胆碱受体 双电极电压钳 非洲爪蟾卵母细胞 药物筛选模型 -
双苯氟嗪对爪蟾卵母细胞上表达的hERG钾通道电流的影响
目的 研究双苯氟嗪对hERG钾通道电流的影响,探讨其抗心律失常作用的可能机制.方法 以非洲爪蟾卵母细胞作为表达系统,采用双电极电压钳技术观察双苯氟嗪对hERG钾通道电流的影响.结果 双苯氟嗪(8 nmol·L-1-5 μmol·L-1)浓度依赖性地抑制hERG电流,IC50为98.0nmol·L-1;在-10 mV～40 mV范围内双苯氟嗪对hERG电流的抑制作用具有电压依赖性;双苯氟嗪1μmol·L-1对半数激活电压无明显影响,但可降低激活时间常数和去活时间常数,加快bERG电流的激活去活.结论 双苯氟嗪降低hERG钾通道电流并改变其动力学特征,提示双苯氟嗪抗心律失常的作用可能与此有关.
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Kir2.1/ Kir2.3嵌合体的构建与表达
目的 构建Kir2.1/ Kir2.3通道嵌合体,为进一步研究Kir2.1和Kir2.3通道的调控机制打下基础.方法 利用重叠延伸PCR方法构建不同的Kir2.1/ Kir2.3嵌合体质粒:N1P3C3,N3P1C1,N3P3C1,N1P1C3,NIP3C1,N3P1C3.将不同的嵌合体质粒分别用NheI线性化后,转录为cRNA表达于非洲爪蟾卵母细胞,用双电极电压钳记录电流.结果 不同的Kir2.1/ Kir2.3嵌合体质粒构建成功,在非洲爪蟾卵母细胞上可以记录到电流表达.结论 成功构建Kir2.1/ Kir2.3嵌合体并完成了嵌合体通道的异源性表达和电压钳记录.
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银杏叶提取物对超极化激活的环核苷酸门控基因编码的起搏通道电生理特性的影响
目的 研究银杏叶提取物对异源表达在卵母细胞上的超极化激活的环核苷酸门控通道(HCN)2、4阻断的电药理学特性及分子机制.方法 将人HCN2、4的mRNA显微注射到非洲爪蟾卵母细胞后,利用双电极电压钳技术记录通道电流.结果 银杏叶提取物呈浓度依赖性阻滞表达在爪蟾卵母细胞上HCN2、4通道,药物半量抑制浓度IC50值分别为0.12±0.05 mg/ml和0.25±0.01 mg/ml.银杏叶提取物对HCN2、4通道阻断的阻断作用是不可逆的,经过15 ～ 20 min药物洗脱,阻滞的HCN电流部分并没有完全恢复到对照水平,只能恢复大约55％ ～75％.在-110 mV时银杏叶提取物对激活时间常数的值明显增大,对HCN2通道从504.6±39.8 ms(n=8)增为588.4±21.7 ms(0.03 mg/ml,n=8,P＜0.05),1176.4±57.3 ms(0.3 mg/ml,n=8,P＜0.05);对HCN4通道从1330.5±59.8 ms (n=8)增为1973.1 ±83.6 ms(0.03 mg/ml,n=8,P＜0.05),而银杏叶提取物对HCN电流的去激活时间常数并未明显改变.结论 银杏叶提取物以浓度依赖性方式不可逆的作用于HCN2、4通道,且对HCN4通道的抑制作用强于HCN2通道,减慢了通道的激活动力学,而对通道的去激活动力学无明显影响.
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稳心颗粒对人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道2电生理特性的影响
目的探讨稳心颗粒对人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道2(HCN2)电生理特性的影响.方法将人HCN2的mRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞,孵育1～2天后,采用双电极电压钳技术观察0.5,1,2,4g/L稳心颗粒对HCN2通道电流的作用.结果①测试电位-90 mV时,0.5,1,2,4g/L稳心颗粒分别使HCN2瞬时电流增加17.74%±6.04%,49.26%±8.74%,86.05%±16.15%和124.38%±11.62%,瞬时电流增加50%的药物浓度(EC50)为1.54±0.24g/L(n=8).②在测试电位-140 mV到-100 mV水平上,2g/L稳心颗粒延长HCN2通道激活时间常数:(226.74±31.37 ms vs 143.68±21.45 ms;-140 mV,n=10,P＜0.05)③2g/L稳心颗粒延长HCN2通道去激活时间常数(1 293.54±95.03ms vs 647.13±61.36 ms;-140 mV,n=10,P＜0.05).结论稳心颗粒呈浓度依赖性增强HCN2瞬时电流,减缓通道激活和去激活过程.
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鼠脑神经递质受体在卵母细胞上的表达
把提取的鼠脑mRNA注射到卵母细胞内，在卵母细胞上以双电极电压钳技术研究某些递质的诱导电流。实验发现除卵母细胞本身所具有的muscarine受体外，还有多种受体明显地在卵母细胞上表达。卵母细胞膜上的表达受体的反应可分平滑型、振荡型、复合型三类。其反应类型与所开启的通道及通透离子有关。平滑型反应的受体与离子通道为一复合体，激动剂开启其自身离子通道。而振荡型反应是递质通过第二信使的介导，引起胞内Ca2+库中的Ca2+释放，开启卵母细胞膜本身的Cl－通道，产生Ca2+依赖的Cl－电流,构成振荡型电流反应的主要成分。复合型二者兼有。
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非洲爪蟾卵母细胞上内源性ATP及GABA激活电流的比较
实验用双电极电压钳技术在具有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞上记录三磷酸腺苷(ATP)与γ-氨基丁酸(GABA)激活电流.并对两者进行了比较.结果显示,在不同的非洲爪蟾卵母细胞上,ATP和GABA受体分布的种类和数目不同;且ATP和GABA激活电流均与K+通道有关.
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大鼠低亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白对枸橼酸及草酸转运电生理特性的研究
目的探讨大鼠低亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白(SDCT1)对枸橼酸及草酸的转运特点.方法克隆出大鼠SDCT1全长cDNA基因.应用爪蟾卵母细胞异源性表达SDCT1,并使用双电极电压钳法记录通道电流.通过改变灌流液中枸橼酸、草酸的浓度,以及两种底物转运时钠离子的浓度及pH值,对其特性进行了研究.结果SDCT1对枸橼酸及草酸的转运均为底物浓度及钠离子依赖.pH值变化显著影响2者的转运.但低pH对草酸的转运影响要远大于枸橼酸.结论在临床实践中,虽然升高尿液pH值可以抑制枸橼酸的重吸收,发挥其抑制钙盐沉积的功能.但过度地碱化尿液也会使草酸的重吸收受到抑制,使草酸大量存留在尿中而导致结石.保持适当的尿酸碱度是必要的.
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大鼠脑组织mRNA在非洲爪蟾卵母细胞的表达--外源性GABAA受体与内源性GABAA和GABAB受体的比较
目的本文利用在非洲爪蟾卵母细胞表达外源基因的技术,对比研究卵母细胞内源性GABA受体和表达的鼠脑GABA受体,为进一步进行递质与受体的研究奠定方法学基础.方法实验采用Trazol试剂法及oligo-dt纤维素柱过柱法,从20只大鼠脑组织抽提多聚腺嘌呤mRNA,注入非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的受体,并利用电压钳方法记录受体激活电流.结果卵母细胞内源性GABA受体和表达的鼠脑GABA受体存在多方面的不同.结论本实验建立的表达模型在研究递质与受体功能、结构、药理学特性等方面起到一定的参考作用.
