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人脂肪来源间充质干细胞库的初步建立
目的 探讨建立生物学性状稳定的人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)库的可行性,旨在为组织工程种子细胞提供更多来源.方法 对分离得到的hADSCs采用液氮低温冻存,并在一定时间复苏培养,以流式细胞仪检测其表面抗原,在诱导培养基中对其进行成脂和成骨诱导培养,光镜下观察细胞形态,免疫组织化学方法检测成骨诱导的特异标志物碱性磷酸酶(ALP)的表达,观察hADSCs在复苏前后的分化能力.结果 从脂肪组织中分离培养扩增获得数目稳定的hADSCs,经冻存并复苏后的hADSCs形态和表面抗原保持不变,可继续扩增10代以上,倍增时间为48h.复苏后第2、第6、第10代hADSCs均保持了较强的成脂及成骨分化能力.结论 初步建立hADSCs库,可为再生医学修复重建组织工程提供较好的种子细胞.
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颅内动脉瘤手术废弃脑组织中成人自体神经干细胞的培养与鉴定
背景:对胎儿、胎鼠及成鼠神经干细胞培养已有大量研究,但成体人自体神经干细胞培养相关研究较少.目的:通过改进原代培养方法,从颅内动脉瘤破裂脑出血患者血肿腔周边废弃脑组织中培养和鉴定神经干细胞,并进行冻存与复苏研究,建立成人自体神经干细胞库.方法:收集3例动脉瘤破裂脑出血(2例大脑中动脉瘤及1例前交通动脉瘤)手术中血肿腔周边的废弃脑组织各约500 mg以上,采用细小组织块接种法进行原代无血清悬浮培养成人自体神经干细胞,倒置显微镜下观察细胞生长情况,免疫荧光细胞化学技术检测神经干细胞标志物巢蛋白(Nestin)的表达.培养获得的神经干细胞球以体积分数4%胎牛血清诱导其贴壁生长,待细胞增殖达到一定数量后传代培养.传代后部分细胞予以冻存建库,并复苏继续传代及诱导分化培养.体积分数10%胎牛血清诱导神经干细胞分化,通过免疫荧光细胞化学技术检测胶质纤维酸性蛋白(标记星形胶质样细胞),β-tubulinⅢ(标记神经元样细胞),SOX10(标记少突胶质样细胞)蛋白的表达来测定神经干细胞的分化能力.结果与结论:改进培养方法后,3例患者废弃脑组织中,在无血清培养液中均可形成Nestin阳性表达的神经球,并可在体外大量扩增和连续传代.在给予体积分数10%FBS条件下神经球可分化为神经元样细胞、少突胶质细胞及星形胶质细胞,即β-tubulinⅢ,SOX10及胶质纤维酸性蛋白阳性表达.经传代培养至5代后,仍呈Nestin阳性即可维持其神经干细胞特征.冻存细胞复苏后生长状态良好且呈Nestin阳性,可继续传代扩增.结果表明,从动脉瘤破裂脑出血患者不同脑区(颞极及额底)血肿腔周边废弃脑组织中可成功培养获得自体神经干细胞,并可向神经元样细胞、少突胶质样细胞及星形胶质样细胞分化,使自体神经干细胞移植促进神经功能修复从实验室到临床应用成为可能.
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低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响
目的:比较人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)冻存前和复苏后的生物学特性,为今后建立低温干细胞库提供实验支持.方法:采用0.1％Ⅰ型胶原酶消化法从腹部大网膜脂肪组织中分离hADSCs,体外培养扩增,将处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs置于液氮中分别冻存1、3和6个月,复苏后台盼蓝染色检测细胞存活率,采用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面抗原,成脂成骨诱导后鉴定多向分化能力,RT-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(peroxisome proliferator-activated receptorγ-2,PPARγ-2)和成骨特异性基因骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况.结果:随冻存时间的延长细胞存活率略有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05).MTT结果显示冻存前后细胞增殖能力均很强.流式细胞检测结果显示冻存前后细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,低表达CD45和HLA-DR.冻存前后hADSCs均具有向脂肪细胞和骨细胞分化潜能,且RT-PCR结果显示,PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达冻存前后差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:经液氮冻存后的hADSCs具有高存活率,生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能.
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应用骨髓库HLA资料构建高匹配诱导多能干细胞库的可行性研究
目的 研究利用骨髓库HLA资料建立高匹配诱导多能干细胞(ipS)库的可行性.方法 通过对中华骨髓库湖南分库长沙实验室5236(人)份HLA分型数据统计分析,找出O型HLA-A、-B、-DRB1三座位纯合子数据,计算以纯合子志愿者为假定iPS供者、5236名随机志愿者为假定患者的匹配几率；同时计算随机志愿者HLA单体型频率,评估以O型HLA高频单体型纯合子志愿者为假设iPS供者的匹配几率.结果 在5236份骨髓供者资料中共发现O型HLA单体型纯合子14种,以此建库可以分别为49.81％ (2608/5236)、61.29％(3209/5236)、79.51％ (4163/5236)、75.76％ (3967/5236)及97.78％ (5120/5236)的假定患者提供5种匹配水平的iPS供者；共检出17种高频率(HF＞1％)的单体型,以这些单体型的O型纯合子建库可以分别为64.06％ (3354/5236)、75.55％ (3 956/5 236)、81.11％ (4 247/5 236)、78.76％ (4124/5236)及98.28％ (5146/5236)的假定患者提供5种匹配水平的iPS供者.结论 利用中华骨髓库现有的HLA资料可以建立数量少、效率高的iPS细胞库.
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乳牙牙髓干细胞库的构建及其研究进展
干细胞库是指以人体干细胞移植为目的,具有采集、处理、保存和提供多向分化干细胞能力的储存库,曾被人称为"生命银行".从个体牙髓中获取干细胞并储存入库备用是一个可行的、相对微创且能取代从其他组织来源获取干细胞的途径.乳恒牙替换是一个正常的生理现象,从脱落的乳牙牙髓中分离培养出干细胞用于储存是建立干细胞库的简单、较易被接受的方法,并为日后治疗机体外伤和病变提供了一个很好的组织工程学种子细胞来源.更重要的是,用个体化的干细胞进行自体移植再生性治疗,能大限度降低免疫排斥和疾病交叉感染的风险.本文就建立乳牙牙髓干细胞库的设想、研究进展和技术细节作一综述.
