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Erbin基因沉默对乳腺癌细胞生物学行为的影响
目的:观察Erbin基因表达沉默后对乳腺癌细胞形态及侵袭迁移生物学行为的影响.方法:通过慢病毒shRNA 转染技术建立低表达Erbin的乳腺癌细胞模型.蛋白质印迹法检测基因沉默前后Erbin蛋白表达的效果；倒置显微镜观察基因沉默前细胞形态改变；Matrigel-Transwell小室法检测细胞侵袭能力改变；Transwell小室法检测细胞迁移能力改变.蛋白质印迹法检测转移相关基因基质金属蛋白酶-2(matrix metallopro teinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(ma-trix metalloproteinase-9,MMP-9)表达改变.结果:成功建立了Erbin基因沉默乳腺癌细胞模型.蛋白质印迹法显示,稳定表达Erbin-shRNA细胞的Erbin蛋白表达明显被抑制,Erbin基因沉默后乳腺癌细胞变长、变梭,细胞间隙明显增宽,侵袭能力为56.3±7.6,明显高于空载体转染组的29.3±2.1,t=-5.908,P=0.004;迁移能力为83.6±7.2,较空载体转染组的52.6±8.3显著增强,t=-4.868,P=0.008.Erbin-shRNA转染后转移相关基因MMP-2表达为0.74±0.021,较空载体组的0.25±0.039明显上调,t=-19.23,P＜0.001；MMP-9的表达为0.78±0.037,较空载体组的0.32±0.078也显著上调,t=-10.02,P=0.001.结论:Erbin基因的表达沉默对乳腺癌细胞的部分恶性生物学行为的发生有一定促进作用,可促进细胞变长、变梭,促进细胞侵袭迁移能力增强.
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Erbin表达缺失诱导MDA-453人乳腺癌细胞对曲妥珠单抗耐药
目的：探索Erbin表达缺失导致Her2阳性的人乳腺癌细胞MDA-453对曲妥珠单抗敏感性的影响。方法设计、构建含人Erbin基因特异性的短发夹RNA（ shRNA）及对照shRNA的干扰载体，转染MDA-453人乳腺癌细胞。经G418加压筛选，获得稳定敲低Erbin的MDA-453细胞（ MDA-453-Erbin sh）和稳定表达对照shRNA的MDA-453细胞（ MDA-453-NC），以后者作为对照细胞。应用Western印迹法检测MDA-453-NC和MDA-453-Erbin sh细胞中Erbin表达水平。分别通过细胞增殖活性实验及细胞集落形成实验，观察敲低Erbin的MDA-453细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。通过免疫组化染色法，分析Erbin在人乳腺癌及正常乳腺组织中的表达。结果建立了稳定敲低Erbin的MDA-453细胞株，发现敲低Erbin表达可诱导MDA-453细胞对曲妥珠单抗产生抗性。与正常乳腺上皮组织相比，人乳腺癌组织标本中Erbin表达水平降低。结论 Erbin表达缺失可能影响乳腺癌对曲妥珠单抗治疗的敏感性。
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抗Erbin特异性单克隆抗体的制备及鉴定
目的:制备抗Erbin单克隆抗体.方法:应用基因工程技术构建含Erbin PDZ序列的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)以获得重组蛋白的表达;采用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白;通过质谱鉴定重组蛋白;利用纯化的重组蛋白免疫小鼠,通过细胞融合技术制备单克隆抗体.结果:构建了原核表达载体pET-28a(+)-Erbin PDZ,获得了重组蛋白在工程菌中的高效表达.通过对以包涵体形式存在的重组蛋白进行洗涤、溶解、复性和纯化,获得了纯度在90%以上的重组蛋白.经质谱鉴定确证表达的重组蛋白为Erbin PDZ.用重组蛋白免疫小鼠后,经细胞融合、筛选及鉴定,获得了高效价的单克隆抗体.讨论:该抗体可识别天然状态下的Erbin蛋白,可用于ELISA、免疫荧光和免疫沉淀实验.抗Erbin单克隆抗体的制备为研究Erbin的功能奠定了基础.
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ERBIN蛋白PDZ结构域结合蛋白的筛选和鉴定
目的 筛选和鉴定ERBIN蛋白的PDZ结构域结合蛋白.方法 以ERBIN蛋白的PDZ结构域为诱饵,采用酵母双杂交系统从人淋巴细胞白血病细胞系的MATCHMAKER cDNA文库中筛选ERBIN PDZ结合蛋白,使用β-半乳糖苷酶(LacZ)活性的定性分析和免疫共沉淀技术鉴定所获结合蛋白识别和结合ERBIN PDZ结构域的结合特性.结果 TAX1蛋白能选择性与ERBIN蛋白的PDZ结构域发生特异性结合.结论 TAX1蛋白是ERBIN结合蛋白家族中的一个新成员.
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沉默Erbin对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖的影响
通过慢病毒干扰技术稳定下调小鼠黑色素瘤细胞株B16中Erbin基因的表达，研究Erbin表达对B16细胞增殖的影响。结果Erbin沉默后B16细胞的增殖能力受到明显抑制。结论 Erbin基因对于黑色素瘤细胞的生长与增殖具有重要生物学意义。
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Erbin在肾缺血再灌注损伤中的表达和作用
目的 探讨ErbB2相互作用蛋白(Erbin)在体内外肾缺血再灌注损伤(IRI)模型中的表达变化及体外细胞转染Erbin对IRI的影响.方法 (1)体内实验:建立肾脏IRI小鼠模型,分为假手术组和再灌注3、6、12、24、48 h模型组.收集并检测各组血清中BUN、Scr水平,采用PAS染色观察肾组织病理变化,TUNEL染色检测细胞凋亡,免疫组化检测Erbin的分布,Western印迹检测Erbin及NF-κB p65的表达变化.(2)体外实验:建立肾小管上皮细胞IRI模型,分别在更换正常含血清培养基后3、6、12、24 h收集细胞,Western印迹检测Erbin的表达变化,流式细胞术及ELISA分别检测细胞凋亡和IL-6、TNF-α炎性因子分泌.质粒Prk5-myc-Erbin瞬时转染建立Erbin过表达模型,分为对照组、IRI组、Erbin组和Erbin+IRI组,分别检测各组细胞Erbin表达、NF-κB激活、细胞凋亡及炎性因子分泌.结果 (1)与假手术组比较,模型组小鼠血Scr、BUN随再灌注时间延长而逐渐升高,24 h达到峰值(P＜0.05);同时再灌注6、12、24、48 h模型组肾小管上皮细胞脱落坏死,管型形成,肾损伤评分和上皮细胞凋亡指数均高于假手术组(均P＜ 0.05),以24 h为显著;24h模型组肾小管内Erbin及细胞核内NF-κB p65的表达高于假手术组(均P＜ 0.05).(2)与对照组比较,IRI组细胞核内NF-κB p65、细胞凋亡率及炎性因子(IL-6、TNF-α)分泌均增加(均P＜0.05);再灌注12、24 h模型组Erbin表达均高于对照组(均P＜ 0.05),24 h组为显著.与IRI组比较,Erbin+IRI组细胞核内NF-κB p65、细胞凋亡率及IL-6、TNF-α分泌均降低(均P＜0.05).结论 Erbin在肾脏IRI中的表达增加.过表达Erbin可抑制IRI组中NF-κB的激活和细胞凋亡及炎性因子的分泌,进而减少肾损伤程度.
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Erbin在肾间质纤维化中的表达和作用
目的 探讨Erbin在肾脏间质纤维化中表达量的变化及上调Erbin对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)转分化的影响.方法 体内实验采用SD大鼠5/6肾切除法建立肾纤维化动物模型,收集并榆测各组血清中Scr、BUN水平;Masson染色观察肾间质纤维化程度;免疫组化及Western印迹检测Erbin的分布与表达.体外实验采用TGF-β1(10 μg/L)刺激NRK52E细胞72 h建立上皮细胞-间充质转分化(EMT)细胞模型;免疫荧光及Western印迹法检测E钙黏蛋白(E-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达变化;RT-PCR及Western印迹法检测Erbin的表达变化.用脂质体2000将质粒Prk5-myc-Erbin瞬时转染至NRK52E细胞,Western印迹法观察上调Erbin表达后对上述各种指标的影响.结果 (1)假手术组大鼠肾功能正常[Scr(33.96±7.28)μmol/L、BUN(8.11±2.55)mmol/L],Masson染色未见肾间质纤维化,Erbin在肾小管表达较少;模型组大鼠Scr[(140.52±61.11)μmol/L]、BUN[(34.23±7.66)mmol/L]均显著高于假手术组(均P＜0.05),肾间质可见明显纤维化,Erbin在肾小管表达也明显增加,是假手术组的2.9倍(P＜0.01).(2)正常NRK52E细胞表达E-cadherin,少量表达Erbin和α-SMA.TGF-β1刺激后,NRK52E细胞E-cadherin表达显著减少,Erbin和α-SMA则表达增加(均P＜0.05);而转染质粒Prk5-myc-Erbin可逆转TGF-β1诱导的NRK52E细胞E-cadherin表达下调,并可抑制α-SMA表达上调(均P＜0.05).结论 Erbin在肾间质纤维化中表达增加,上调Erbin表达可抑制TGF-β1诱导NRK52E发生EMT,提示Erbin在肾脏纤维化中可发挥保护作用.
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1，25-（OH）2D3对单侧输尿管梗阻模型大鼠Erbin表达的影响
目的：探讨活性维生素D3———1，25-二羟维生素D3[1，25-（OH）2D3]对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠Erbin表达的影响。方法将96只大鼠采用随机数字表法随机分为正常对照组、干预组、假手术组和UUO模型组，每组24只。干预组和UUO模型组大鼠在左肾下极处游离并结扎左输尿管建立UUO模型，假手术组开腹后仅游离左输尿管，干预组在建模起给予活性维生素D30.5μg、花生油1 mL灌胃，每天1次，共计14 d，于术后1、3、7、14 d分别处死各组大鼠6只，采用免疫组织化学法检测各组大鼠Erbin、转化生长因子β1（TGF-β1）的表达。结果 UUO模型组大鼠Erbin、TGF-β1表达均明显高于正常对照组、假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）；干预组大鼠Erbin表达明显高于模型组，TGF-β1表达明显低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论1，25-（OH）2D3可能增加UUO大鼠肾组织Erbin的表达，抑制TGF-β1的表达，减轻肾脏纤维化。
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Erbin的分子结构及其生物学功能
ErbB2相互作用蛋白(ErbB2 interacting protein),又称Erbin,是ErbB2的结合伴侣,亦称Densin 180 样蛋白[1].Erbin为富含亮氨酸重复序列及PDZ结构域蛋白(leucine-rich repeat and PDZ-containing protein,LAP)家族的成员.
