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NY-ESO-1基因在膀胱癌中的表达及临床意义的研究
目的 探讨NY-ESO-1的表达与膀胱癌分期分级的关系以及临床意义.方法 回顾性研究2001～2002年膀胱癌组织32例,其中男性24例,女性8例.正常膀胱粘膜对照取自耻骨上经膀胱前列腺切除术的良性前列腺增生的患者.阳性对照为正常睾丸组织.常规行RT-PCR方法检测膀胱癌组织及对照组等NY-ESO-1基因的表达,分析其表达与膀胱癌分期分级的关系以及临床意义.结果 NY-ESO-1 mRNA在32例膀胱癌组织中12例表达(37.5%),在正常膀胱粘膜上没有表达.肿瘤组织中PCR反应的产物与正常睾丸的表达产物一致.NY-ESO-1 mRNA的表达和膀胱癌的病理分级相关,有统计学差异(P＜0.05).NY-ESO-1 mRNA的表达率随着肿瘤病理分级的增高而升高:G1期是0/3(0%);G2期是4/16(25%);G3期是8/13(61.54%).浸润性膀胱癌中NY-ESO-1 mRNA的表达与表浅性肿瘤的表达无显著性差异.结论 NY-ESO-1 mRNA在正常膀胱组织上没有表达,仅在正常睾丸组织和病理膀胱癌组织上有表达.NY-ESO-1 mRNA的表达率随着膀胱癌病理分级的增高而升高.
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MAGE-A4重组蛋白的原核表达与纯化
目的 构建MAGE-A4的原核表达质粒并表达纯化相应蛋白,为恶性肿瘤的早期诊断和基因治疗疫苗的研制奠定基础.方法 根据目的基因序列合成目的基因并与原核表达载体连接,以构建原核表达质粒pET30a(+)/MAGE-A4,将酶切鉴定及测序正确的重组质粒转入E.coli BL21,经IPTG诱导表达并行可溶性分析,Western Blot鉴定重组蛋白特异性后,通过亲和层析法纯化重组蛋白.结果 成功构建pET30a (+)/MAGE-A4原核表达质粒,诱导表达得到重组蛋白MAGE-A4,主要以可溶性形式表达,纯化后获得纯度较高的蛋白.结论 成功构建pET30a(+)/MAGE-A4原核表达质粒并表达纯化出具有生物学活性的重组蛋白MAGE-A4.
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睾丸组织中的TSP50启动子甲基化差异的研究
目的:检测不同组织中TSP50启动子区域的甲基化状态,研究其表达的机制.方法:分离、纯化鼠睾丸中的精原细胞、精母细胞和精子,分别提取人的睾丸组织、Ntera-2细胞、鼠精原细胞、精母细胞和精子的基因组DNA,用重亚硫酸盐处理基因组DNA,PCR扩增人和鼠的TSP50的启动子CpG岛区域,电泳,提纯,连接于质粒中,转导入细胞中,扩增,提取,纯化质粒,测序.结果:人睾丸组织甲基化水平较低,Ntera-2细胞处于较高水平.鼠的精原细胞和精子细胞甲基化水平较高,精母细胞甲基化水平较低.结论:TSP50启动子区域甲基化位点的甲基化水平调控TSP50蛋白的表达.
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精子蛋白Ropporin的研究进展
Ropperin一直以来被认为是精子细胞特异性蛋白,在睾丸组织中特异性表达,并参与精子的运动、获能、顶体反应等生理活动.然而,新的研究表明Ropporin在正常的非睾丸组织也有微弱表达,而且作为一种新的肿瘤睾丸抗原(CT抗原)在恶性血液病的肿瘤细胞中高表达.Ropporin在哺乳动物中的表达具有高度保守性,说明它对生命的重要性.本文就Ropporin的特性、表达与分布、生理学功能及临床研究的新进展进行了综述.
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应用CT抗原肽诱导肝癌患者特异性细胞毒反应的研究
目的研究应用不同肿瘤睾丸抗原(CTA)多肽诱导肝细胞肝癌(HCC)患者特异性细胞毒反应的情况.方法 RT-PCR方法检测一例HLA-A2阳性表达的HCC患者肝癌组织中三种CT抗原(MAGE-1、MAGE-3和NY-ESO-1)基因mRNA的表达情况,用免疫磁珠从该患者外周血单个核细胞(PBMC)中分离出CD8+T细胞作为效应细胞;将其余自体CD8-PBMC分别与三种CT抗原肽共孵育,经γ-射线照射后作为抗原呈递细胞(APC),分别与CD8+效应细胞进行混合淋巴细胞培养.7天后同法再刺激患者的CD8+T细胞1次,诱导形成细胞毒T淋巴细胞(CTL).同时取相同的CD8+效应细胞,加入IL-2培养作为对照组.培养两周后将三种CT抗原肽刺激的效应细胞,分别与带有相应抗原肽的T2靶细胞共孵育来检测杀伤效应,效应细胞:靶细胞(E:T)为10:1;用IFN-γ细胞因子分泌检测法,通过流式细胞仪检测产生IFN-γ的效应CD8+ T细胞的频数来反映杀伤活性.结果该患者MAGE-3和NY-ESO-1表达阳性,MAGE-1表达阴性.培养第14天,效应细胞共增加至原细胞数的4倍.NY-ESO-1抗原肽刺激的效应细胞对靶细胞(T2细胞+ NY-ESO-1抗原肽)杀伤活性为10.0%;MAGE-3抗原肽刺激的效应细胞对靶细胞(T2细胞+MAGE-3抗原肽)杀伤活性为8.5%; MAGE-1抗原肽刺激的效应细胞对靶细胞(T2细胞+MAGE-1抗原肽)杀伤活性为3.2%.结论本实验结果表明,应用HCC患者阳性表达的CT抗原肽,可以诱导出该患者特异的细胞毒性T淋巴细胞,其杀伤活性较之无抗原肽和阴性抗原肽刺激明显增强.
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SPAG9mRNA在DAC干预A549细胞前后的表达
目的 检测DAC干预前后A549细胞中SPAG9的表达，探讨SPAG9表达的生物学机制。方法 实时荧光定量PCR(RQ-PCR)法检测肺组织标本和DAC干预A549细胞前后SPAG9mRNA的转录情况。结果 DAC干预A549细胞前后SPAG9的表达差异性显著，随甲基化状态的延长而减弱。结论 低甲基化状态抑制SPAG9表达。SPAG9在肺癌的早期高度表达，中晚期表达减弱，可作为肺癌早期诊断和治疗的生物学参考指标之一。
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肿瘤睾丸抗原基因研究进展
当前,导致人类死亡的主要原因之一为恶性肿瘤.WHO统计结果显示,每年约有700万人因肿瘤而死亡[1],而且这一数字呈逐年递增趋势.肿瘤发生是一个长期累积的过程,受多基因控制和多因素调节.诸如手术、化疗、放疗等传统治疗方法由于受适应证、禁忌证和毒副反应等因素的限制,治疗效果仍不理想.20世纪80年代以来,随着一系列鉴定肿瘤睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)方法的逐渐建立,CTA的发现和鉴定成为可能,为肿瘤主动免疫治疗和靶向治疗的发展提供了新思路.
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大肠癌组织中肿瘤睾丸抗原前列腺相关基因4的表达及其临床意义
目的 筛选大肠癌相关肿瘤睾丸抗原,为大肠癌肿瘤的诊断和免疫治疗提供依据.方法 样本取自本院的大肠癌患者46例,包括癌组织(原发灶)、癌旁组织.提取样本核糖核酸(RNA)后逆转录合成单链互补脱氧核糖核酸(cDNA),利用聚合酶链反应(PCR)技术测定前列腺相关基因4 (PAGE4)在各组织中的相对表达量并进行分析.结果 有转移患者癌组织中PAGE4相对表达量(9.85×10-4 ±3.67×10-3)与无转移患者癌组织中相对表达量(3.93 ×10-5±1.20×10-4)差异有统计学意义(P＜0.05);有转移患者癌组织中PAGE4表达阳性率(25％)与癌旁组织(0)比较差异有统计学意义(P＜0.05);无转移患者癌组织中PAGE4表达阳性率(19.2％)与癌旁组织(11.5％)比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PAGE4的表达可作为肿瘤转移的预测因素,转移性大肠癌者可能是针对PAGE4标靶的肿瘤免疫治疗的适宜人群.
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外周血肿瘤-睾丸抗原基因mRNA检测对小肝癌诊断的价值
目的 探讨肿瘤睾丸(CT)抗原MAGE-1、SSX-1及CTp11基因mRNA的小肝癌患者外周血中的表达及诊断价值.方法 用巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测30例小肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中上述3种基因的表达.结果 小肝癌患者PBMC中MAGE-1、SSX-1和CTp11基因mRNA的阳性表达率分别为26.6％(6/30)、26.6％(6/30)和16.6％ (5/30),有40.0％ (12/30)患者PBMC标本中可以检测到其中1种CT抗原基因表达.在血清甲胎蛋白(AFP)阴性及低浓度阳性小肝癌患者PBMC中其阳性率为58.7％ (9/24),此结果与血清AFP检测结果联合起来,可显著提高单纯根据AFP检测结果所做出的诊断率(50.0％比20.0％,P＜0.05).结论 外周血中MAGE-1、SSX-1及CTp11基因mRNA的检测有助于小肝癌的诊断.
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肿瘤睾丸抗原丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶31在大肠癌组织中的表达及其临床意义
目的 筛选大肠癌相关肿瘤睾丸抗原丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶31(STK31),为大肠癌的诊断和靶向治疗提供依据.方法 样本取自本院大肠癌患者及正常人,包括血液、原发灶(癌灶),其中大肠癌45例(转移18例、非转移27例)及正常人为对照(15例).提取样本RNA后逆转录合成cDNA,利用聚合酶链反应(PCR)扩增技术测定STK31在各组织中的表达水平,并进行统计学分析.结果 转移性大肠癌原发灶(0.007 78±0.010 80)与非转移癌原发癌灶中(0.00240±0.005 31),STK31的表达量差异有统计学意义(P＜0.01);未转移大肠癌(0.000 481±0.000458)与转移性大肠癌(0.000 177±0.000 223)外周血中STK31的表达量差异有统计学意义(P＜0.05),两者与正常人(0.000 275±0.000312)外周血比较STK31的表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 STK31在转移大肠癌肿瘤组织中的表达明显升高,可作为大肠癌转移的预测因素.
关键词： 肿瘤睾丸抗原 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶31 大肠癌 转移 -
肿瘤-睾丸抗原SSX1和SSX4 mRNA在肝细胞癌中的表达
目的检测肿瘤-睾丸抗原(CTA)SSX1和SSX4mRNA在肝细胞癌(HCC)及外周血中的表达,探讨CTA抗原SSX1和SSX4在HCC中表达有无特异性.方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对35例HCC患者癌组织和相应的癌旁组织SSX1和SSX4基因表达进行检测,对其中6例RT-PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定;HCC确诊后第2周对30例患者外周血中SSX1基因进行检测.结果35例HCC患者中,SSX1和SSX4的表达率分别为77.1%(27/35)和65.7%(23/35);癌旁组织、12例肝硬化和15例正常肝组织未检测到SSX1和SSX4的表达.6例DNA序列测定结果显示RT-PCR产物为SSX1和SSX4的cDNA.SSX1和SSX4的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、血清甲胎蛋白(AFP)水平、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染无相关关系(均P＞0.05).外周血中未检测到SSX1表达.结论SSX1和SSX4在HCC中呈高度特异性表达,是制备HCC疫苗理想的靶向分子,多种CTA联合表达为多效价疫苗治疗HCC提供了理论基础.
关键词： 癌 肝细胞 肿瘤睾丸抗原 逆转录-聚合酶链反应 -
卵巢癌相关肿瘤睾丸抗原的研究进展
卵巢癌从本质上来说是一种免疫原性肿瘤，以免疫治疗为主的生物治疗已成为备受人们关注的一种新的辅助治疗卵巢癌的方法。肿瘤睾丸抗原参与肿瘤的发生、发展，可以作为肿瘤标志物或治疗靶标，是当前肿瘤免疫诊断和免疫治疗的研究热点。多项研究表明，肿瘤睾丸抗原对卵巢癌的早期诊断和治疗具有较好的前景。本文综述目前在卵巢癌中研究较为广泛的3种肿瘤睾丸抗原（cancer testis antigen，CTA）NY-ESO-1、精子蛋白17（sperm protein 17，Sp17）和精子相关抗原9（sperm associated antigen 9，SPAG9）的研究进展。
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NY-ESO-1在肿瘤中的表达及其临床意义研究进展
纽约食管鳞状上皮癌抗原1（NY‐ESO‐1）是肿瘤睾丸抗原（CTA）亚家族之一，编码基因早发现于食管癌组织cDNA表达文库中。NY‐ESO‐1在细胞内经加工产生抗原肽，与人类白细胞抗原（HLA）分子结合形成复合物，经CD4＋ T淋巴细胞及细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）识别，可诱导机体产生针对相应肿瘤细胞的较强的特异性免疫应答［1‐2］。本文就近年来N Y‐ESO‐1在肿瘤中的表达及其临床意义研究进展作一综述。
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抗人BORIS单克隆抗体的制备及在乳腺疾病和正常乳腺组织中的分布
目的:制备抗BORIS的单克隆抗体(mAb), 并在蛋白水平上研究BORIS抗原在乳腺癌、良性乳腺病及正常乳腺组织(癌旁远端组织)上的分布特点.方法:以人BORIS重组蛋白免疫BALB/c小鼠, 应用B淋巴细胞杂交瘤技术建立分泌抗BORIS mAb的杂交瘤细胞株.用免疫组化染色法检测BORIS抗原在睾丸组织、乳腺癌、乳腺良性病和正常乳腺组织(癌旁远端组织)中的表达.结果:获得 4株稳定分泌抗BORIS mAb的杂交瘤细胞株.其中抗体编号为FMU-BORIS13( IgG1)可用于免疫组化的染色.结果显示, BORIS抗原在正常睾丸的精原细胞和精母细胞的细胞核内表达, 符合CT抗原的表达特点.组织芯片的免疫组化染色结果显示其在乳腺癌组织中呈高水平的表达, 阳性率为85% (94/110), 在良性乳腺病组织中其表达的阳性率为95%(21/22 ).另外, 在6例乳腺癌癌旁远端近似于正常的乳腺组织中也检测到BORIS抗原的表达.BORIS抗原在乳腺癌组织中的表达远高于其在良性乳腺病和正常的乳腺组织(癌旁远端组织)中的表达.结论:BORIS的高表达可能与乳腺癌的发生发展有一定的关系.
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PRM1,一个新的候选结肠癌相关CT抗原基因的识别及其在结肠癌组织中的表达分析
目的 筛选新的肿瘤/睾丸抗原相关基因,为肿瘤的诊断和治疗提供理论依据.方法 利用文献报道的大规模平行信号测序技术获得的人类33种正常组织的基因表达谱,经生物信息学分析筛选出睾丸富集表达基因.利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,在15种人类正常组织中对候选基因进行验证,后利用荧光定量PCR技术对睾丸特异基因在结肠癌组织和癌旁组织中的表达差异进行分析.结果 在15种人类正常组织中,PRM2,PRM1,TNP1,AKAP4,TCP11为睾丸特异性表达,在其它组织中均无表达.其中PRM1基因在50%(6/12)的结肠癌组织中有明显的上调(>2倍).其它基因在结肠癌中表达与癌旁组织比较无统计学差异.结论 PRM1可能是一个新的CT基因,结果显示PRM1基因可能会在结肠癌的分子诊断或者免疫治疗中起到重要作用.
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膀胱癌肿瘤/睾丸抗原相关基因的表达
目的:检测多种肿瘤/睾丸抗原相关基因在膀胱癌中的表达状况.方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对33例膀胱癌患者癌组织和癌旁正常膀胱组织进行MAGEA1,SSX2,NY-ESO-1,MAGEC1,MAGEE1和HAGE的mRNA表达检测.随机抽取每种CTA基因的3例阳性RT-PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定.结果:33例膀胱癌标本中MAGEA1,SSX2,NY-ESO-1, MAGEC1,MAGEE1和HAGE的表达频率分别为21.2%(7/33),39.4%(13/33),69.7%(23/33),42.4%(14/33),36.4%(12/33)和24.2%(8/33).正常膀胱组织中6种CTA基本无表达.肿瘤组织中6种基因至少有1种表达的频率是75.8%(25/33),两种或两种以上同时表达几率是69.7%(23/33).测序结果表明RT-PCR产物确为CTA目的基因序列.结论:CTA在膀胱癌主动免疫治疗中是一种合适的、有前景的攻击靶点.同时,多种CTA的联合表达为多效价CTA疫苗在膀胱癌免疫治疗中的应用提供了理论基础.
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食管鳞癌SALL4和MAGE-A1的特异性免疫反应
目的 检测食管鳞癌患者婆罗双树样基因4 (SALL4)和黑色素瘤抗原A1 (MAGE-A1)特异性细胞免疫水平,探讨其患者的特异性免疫应答及其与临床特征的相关性,为食管鳞癌的临床免疫治疗潜在靶点的选择提供实验依据.方法 收集2015年4月-2016年10月新疆医科大学附属肿瘤医院放疗中心收治的食管鳞癌初治患者51例,用合成的肿瘤睾丸抗原(CTA)中的SALL4和MAGE-A1特异性抗原表位肽刺激患者外周血单个核细胞(PBMC),采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测分泌γ干扰素(IFN-γ)细胞的频率及强度,并分析其与食管鳞癌患者临床特征的关系.结果 食管鳞癌患者外周血中,SALL4和MAGE-A1特异性CTL反应频率分别为29.4％(15/51)和27.5％(14/51),反应强度分别为78.0、5 5.7 SFC/106 PBMCs;N0～1组MAGE-A1特异性CTL反应频率(37.5％)明显高于N2～3组(10.5％) (P =0.037);SALL4特异性CTL免疫反应频率与MAGE-A1呈现弱的正相关性(r=0.471,P=0.000).结论 食管鳞癌患者可对肿瘤特异性抗原SALL4和MAGE-A1多肽产生特异性T细胞免疫反应,并可为食管鳞癌免疫治疗的临床应用提供线索.
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恶性纤维组织细胞瘤中肿瘤睾丸抗原相关基因的表达
目的：检测肿瘤睾丸抗原相关基因在恶性纤维组织细胞瘤中的表达，探讨其作为靶抗原用于恶性纤维组织细胞瘤特异性免疫治疗的可能性。方法收集2010年4月至2015年1月确诊为恶性纤维组织瘤并行手术治疗的27例患者的肿瘤组织及癌旁组织。其中男17例，女10例；年龄31～83岁，平均（58.7±13.5）岁；临床分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期4例；组织学分型：多形性14例，巨细胞性8例，炎性5例。用逆转录-聚合酶链反应方法对其肿瘤睾丸抗原相关基因（WT1，MPP11，PRAME，RHAMM，NY-CO-38，G250，NY-ESO-1，HTERT，BAGE）的表达进行检测。结果27例恶性纤维组织瘤中肿瘤睾丸抗原相关基因的表达频率分别为 WT177.8%（21∕27），MPP1174.1%（20∕27），PRAME 63.0%（17∕27），RHAMM 59.3%（16∕27），NY-CO-3851.9%（14∕27），G25044.4%（12∕27），NY-ESO-144.4%（12∕27），HTERT 40.7%（11∕27），BAGE 14.8%（4∕27）。9种肿瘤睾丸抗原相关基因在正常纤维组织中均无表达。肿瘤睾丸抗原相关基因在恶性纤维组织瘤中表达率高的 WT1与临床相关指标（性别、年龄、组织学亚型、临床分期）无显著相关性（P ﹥0.05）。结论 WT1等在恶性纤维组织瘤中呈现高表达，作为主动免疫治疗中的攻击靶点，具有很大的潜力。
