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龙胆苦甙对减轻乳鼠心肌缺血再灌注损伤的细胞研究
目的：观察龙胆苦甙（Gentiopicroside，GPS）后处理对离体心肌细胞缺血/再灌注损伤（ischemia and reperfusion injury，I/R）的拮抗作用及其可能的机制。方法采用SD大鼠乳鼠培养心肌原代细胞，用缺氧复氧模型模拟缺血再灌注（stimulated ischemia reperfusion，SI/R）。实验分为正常对照组（Control＋ScrambleRNA＋Veh）；缺氧复氧组（I/R＋ScrambleRNA＋Veh）；缺氧复氧＋龙胆苦甙后处理组（I/R＋ScrambleRNA＋GPS 组）以及缺氧复氧＋AktSiRNA＋龙胆苦甙后处理组（I/R＋AktSiRNA＋GPS）。采用化学法缺氧复氧模型，缺氧2 h，复氧4 h。复氧前给予GPS药物，检测心肌细胞乳酸脱氢酶（LDH）以及TUNEL染色确定心肌细胞的损伤程度以及抑制Akt表达后GPS的保护作用变化。结果与I/R＋ScrambleRNA＋Veh组相比，I/R＋ScrambleRNA＋GPS组LDH明显降低（P＜0.01），TUNEL染色阳性率增加减少（P＜0.01），Akt/Gsk3β信号通路磷酸化程度明显增加（P＜0.01）。与I/R＋ScrambleRNA＋GPS组相比，SI/R＋SiAktRNA＋GPS组，LDH活性显著增加（P＜0.01），TUNEI染色阳性率增加（P＜0.01），Gsk3β磷酸化程度减弱（P＜0.01）。结论 GPS后处理对I/R大鼠心肌具有保护作用，其作用机制与AKT/Gsk3β信号通路的活化有关。
关键词： 再灌注损伤 龙胆苦甙 Akt/Gsk3β信号通路 -
TRPV4对脑血管平滑肌增殖及凋亡的影响
目的 探究新型钙离子通道香草醛受体4(transient receptor potential vanilloid receptor,TRPV4)对自发性高血压(spontaneously hypertensive rats,SHR)大鼠脑血管平滑肌增殖及凋亡的影响.方法 分离并培养大鼠脑基底动脉平滑肌细胞(basilar arterial smooth muscle cells,BASMCs),采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot)法检测细胞中TRPV4的表达.转染TRPV4 siRNA沉默TRPV4基因,CCK-8检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期及凋亡;Western blot检测cyclinD1、p-Rb、Bcl-2、cleaved-caspase-3/caspase-3、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达.结果 qRT-PCR及Western blot结果显示自发性高血压大鼠BASMCs中TRPV4的表达明显高于对照组大鼠.而在自发性高血压大鼠BASMCs中,沉默TRPV4可抑制细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导其凋亡;此外还可下调cyclinD1、p-Rb、Bcl-2、p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达,同时上调cleaved-caspase-3蛋白的表达. 结论 沉默TRPV4能够抑制自发性高血压大鼠BASMCs细胞增殖,同时促进细胞凋亡,机制可能与抑制AKT/GSK3β信号通路的激活有关,所以新型钙离子通道TRPV4可为今后靶向诊疗高血压脑血管疾病提供依据.
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Ghrelin对高脂喂养大鼠肝脏氧化应激及Akt/GSK3β信号通路的影响
目的 探讨Ghrelin对高脂喂养的大鼠肝脏氧化应激水平及Akt/GSK3β信号通路的影响.方法 成年雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、高脂饮食组(HFD组)和Ghrelin组,每组10只小鼠.NC组给予正常饲料喂养,HFD组及Ghrelin组给予高脂饮食,喂养6周后,进行药物干预4周:Ghrelin组给予Ghrelin(60 μg/kg)每日两次腹腔注射,相应NC组及HFD组给予0.9%氯化钠溶液进行对照;结束后处死大鼠,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、三酰甘油(TG)及总胆固醇(TC);测定肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA);实时 PCR检测肝脏组织Akt、GSK3β mRNA表达的改变.结果 Ghrelin 组大鼠肝脏湿重、血TC及TG均低于HFD组(P<0.05);Ghrelin组与HFD组比较,SOD明显增高(P<0.05),MDA有所降低 (P>0.05);Ghrelin组与HFD组相比,肝脏组织Akt基因mRNA表达升高1.03倍 (P>0.05),GSK3β基因mRNA表达升高3.23倍,(P<0.05).结论 Ghrelin 能改善高脂喂养大鼠血脂水平,减轻氧化应激损伤,其作用机制可能与Akt/GSK3β信号通路相关.
关键词： Ghrelin 非酒精性脂肪肝 高脂饮食 氧化应激 Akt/Gsk3β信号通路 -
ABT-263诱导A431细胞凋亡及其对AKT下游信号通路影响
目的 观察抗凋亡蛋白抑制剂ABT-263对人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431细胞功能的影响,并探讨相关分子机制.方法 ①取对数生长期的人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)与A431细胞提取总蛋白,采用蛋白印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)和BCL-XL的蛋白表达水平.②分别以浓度为50 μmol/L的ABT-263(抑制剂组)和二甲基亚砜(对照组)处理A431细胞,培养4和9h后,采用透射扫描电子显微镜(TEM)检测各组细胞的形态变化.③以剂量为0、10、25、40和50 μmol/L的ABT-263处理A431细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力.④以不同剂量的ABT-263处理A431细胞,采用蛋白印迹法检测活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)、活化聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)ser473、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(pGSK3β)和磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)的蛋白相对表达水平.结果 A431细胞中的BCL-2和BCL-XL蛋白相对表达水平均高于HaCaT细胞(P＜0.01).TEM检查结果显示,抑制剂组A431细胞从正常的形态逐渐变化为凋亡的形态,表现为微绒毛消失,核染色质密度增高并凝聚在核膜周边,核仁裂解.10、25、40和50 μmol/L剂量组A431细胞的细胞活力均低于对照组(P＜0.05).10、30和50 μmol/L剂量组A431细胞的活化Caspase-3和活化PARP-1蛋白的相对表达水平均高于对照组(P＜0.05).10、25、40、50 μmol/L剂量组A431细胞的pAKT(ser473)和pGSK3β的蛋白相对表达水平均低于对照组(P＜0.05),γH2AX蛋白相对表达水平高于对照组(P＜0.05).A431细胞活力和pGSK3β蛋白相对表达水平均随抑制剂剂量的增加而减少(P＜0.01),活化Caspase-3和γH2AX的蛋白相对表达水平均随抑制剂剂量的增加而增加(P＜0.01),均呈剂量-效应关系.结论 ABT-263可诱导A431细胞发生线粒体途径的凋亡,并可诱导AKT/GSK3β信号通路失活,从而促进A431细胞凋亡,呈一定程度的剂量-效应关系.
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骨髓间充质干细胞对狼疮鼠B淋巴细胞AKT/GSK3β信号通路影响的检测
目的:研究骨髓间充质干细胞(BM-MSC)对MRL/lpr狼疮鼠B淋巴细胞活化及AKT/GSK3β信号通路的影响.方法:从C57/BL6小鼠骨髓细胞中分离培养BM-MSC,用不同剂量的BM-MSC移植治疗MRL/lpr狼疮鼠,4周后免疫磁珠分选出B淋巴细胞,流式细胞仪检测细胞周期,Western Blot检测AKT/GSK3β信号通路相关蛋白表达变化.结果:狼疮鼠B淋巴细胞体外刺激后S期比例明显增多,中、高剂量BM-MSC移植治疗能降低刺激后的狼疮鼠B淋巴细胞S期比例,并增加细胞周期蛋白p27Kip1的表达.BM-MSC移植治疗能抑制B淋巴细胞phospho-AKTThr308及phospho-GSK3βSer9的表达.结论:中、高剂量BM-MSC移植治疗能抑制狼疮鼠B淋巴细胞的异常活化,并抑制AKT/GSK3β信号通路的异常活化.
