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不同细胞因子诱导脐带血有核细胞增殖及杀伤活性的研究
脐血来源丰富,采集方便,富含造血干/祖细胞及各种造血因子[1],且在体外具有增殖分化潜能,近年来倍受国内外研究者们的关注,且已成功地用于临床治疗多种疾病[2,3].
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由重组腺相关病毒1/2载体携带的LacZ报告基因在脐血间质干细胞中的表达
目的:观察由重组腺相关病毒1/2载体携带的LacZ报告基因在体外培养的脐血间质干细胞中的表达情况.方法:实验于2005-10/2006-02在上海交通大学附属新华医院科研中心完成.①以孕龄近60 d的杂种妊娠犬的脐带血作为实验用脐血间质干细胞的标本来源.重组腺相关病毒1/2载体-lacZ基因(北京本原正阳基因技术有限公司).②无菌条件下采集妊娠犬脐带血,置于预装有肝素的离心管中,与Hanks液1∶1混合均匀,叠加于相对密度为1.077的淋巴细胞分离液上,梯度离心分离后进行培养和扩增.③取第4代脐血间质干细胞,经胰酶消化后吹打成单细胞悬液,以5×104/孔接种于24孔板内,随机数字表法分为转染组20孔、空白对照组4孔.转染组将重组腺相关病毒1/2载体-lacZ报告基因(1×1012v.g.mL-1)用不含血清的IMDM培养液作系列滴度稀释,分为5个滴度,即感染复数分别为每个细胞1×102,1×103,1×104,1×105,1×106v.g,各感染复数均设4孔;空白对照组未加入病毒,只加入相同体积的不含血清的IMDM培养液.④转染72 h后采用X-gal化学染色法进行检测,成功转染上LacZ基因的脐血间质干细胞其胞浆内会因合成半乳糖苷酶而呈阳性蓝染.每组样本随机选取5个视野,相差显微镜下计数半乳糖苷酶阳性细胞数,取均值即为LacZ基因细胞转染率.结果:①脐血间质干细胞生长情况及LacZ报告基因表达的检测:转染组病毒基因转染后未再见到明显的细胞增殖,转染72 h后大部分细胞表达LacZ基因并合成半乳糖苷酶,X-gal染色呈蓝色,长梭形;4～6周后细胞形态趋向老化,长梭形逐渐变为宽扁形;8周后细胞均被蓝染,颜色明显较转染72 h时深,细胞形态由长梭形变为不规则,明显老化.空白对照组细胞反应均为阴性.②LacZ报告基因细胞转染率测定结果:转染72 h后,感染复数为每个细胞1×102v.g时,仅有少数细胞蓝染呈阳性;感染复数为每个细胞1×103,1×104,1×105,1×106 v.g时,转染率分别为(43±5)%,(82±4)%,(95±4)%,(97±3)%.结论:体外培养的脐血间质干细胞能高效转染重组腺相关病毒1/2载体-lacZ报告基因,在一定感染复数范围内,细胞转染率随着感染复数的增加而升高.提示脐血间质干细胞是重组腺相关病毒1/2载体-lacZ报告基因转染的适宜靶细胞.
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Survivin基因在人胎儿血中的表达
目的:观察Survivin基因在人胎儿血中的表达及其意义.方法:实验于2003-10/2004-03在广西医科大学第一附属医院血液科完成.①实验材料:50份胎儿血、40份足月脐带血分别取自广西民族医院及南宁第二人民医院妇产科和本院妇产科,产妇均知情同意,并经医院伦理委员会批准.35份成人外周血为无血液系统疾患的健康献血者.②实验方法:无菌操作条件下取EDTA抗凝骨髓液4 mL,常规分离单个核细胞,洗涤后制备合适密度备用.采用RT-PCR技术对50份孕龄为18～32周人胎儿血、40份足月脐带血和35份成人外周血Survivin基因mRNA表达水平进行检测.结果:①Survivin基因在人胎儿血、脐带血及成人外周血表达阳性率的比较:人胎儿血Survivin基因m RNA表达阳性率高于脐血组,差异有显著性意义(68.0%,47.5%,P＜0.05).②Survivin基因在人胎儿血及脐带血中表达水平的比较:人胎儿血Survivin基因m RNA表达水平高于脐带血,差异有显著性意义(0.575±0.276,0.444±0.626,P＜0.05).③Survivin基因表达水平与孕龄的关系:Survivin基因m RNA表达水平随着孕龄增加有下降趋势,对Survivin基因m RNA表达水平与孕龄的相关性进行直线相关分析,结果显示两者之间存在负相关(r=-0.373,P=0.030).结论:①Survivin基因在人胎儿血及脐带血中均有表达,Survivin基因在人胎儿血中表达水平高于脐带血,在成人外周血中检测不到Survivin基因表达.②随着孕龄增加,人胎儿血中Survivin基因表达水平随之下降.③Survivin基因可能在人胎儿发育过程中起一定作用,具体机制还需进一步研究探讨.
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经静脉移植人脐血间充质干细胞在鼠损伤脊髓的表达及神经功能修复
目的:采用Brdu免疫组化标记技术观察经静脉移植人脐血间充质干细胞进入损伤脊髓组织的表达情况,探讨其促进损伤脊髓神经功能恢复的作用.方法:实验于2003-10/2005-03在苏州大学生物技术研究所干细胞实验室完成.①选取健康成年Wistar大鼠60只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、干细胞移植组,20只/组.脐血标本来自苏州大学附属第一医院产科,产妇及其家属均签署知情同意书.②自脐带抽取新鲜脐带血50～60 mL,分离培养人脐血间充质干细胞,调整细胞浓度为5×109 L-1待用.在细胞移植前48 h,体外进行Brdu标记.③模型对照组、干细胞移植组大鼠采用重物压迫法建立脊髓损伤模型.麻醉后取俯卧位,于T11节段处行背后方正中切口,剥离椎旁肌,咬除T11棘突及椎板,显露4 mm×5 mm硬脊膜,将55 g重砝码放置于硬脊膜表面1 min,然后逐层缝合伤口.假手术组仅显露硬脊膜,然后缝合伤口.④造模后5 d,干细胞移植组大鼠自后肢大隐静脉缓缓注人人脐血间充质干细胞悬液0.2 mL～0.3 mL(1×106个).模型对照组、假手术组给予等量生理盐水.⑤分别于细胞移植后1 d、1,2,3周,采用Basso Beatlie Bresnahan(BBB)评分法和斜板试验法测定各组神经功能情况.于细胞移植后1,3周制作冰冻切片,检测各组脊髓组织内脐血间充质干细胞的分布情况.结果:①神经功能检测结果:脊髓损伤细胞移植后3周内,模型对照组、干细胞移植组大鼠后肢运动功能均有所恢复,但干细胞移植组恢复较快,于术后1周BBB评分和斜板试验结果即明显优于模型对照组[(10.71±6.24),(5.13±3.36)分,t=2.39,P＜0.05;(51.67±5.22),(46.63±3.72)度,t=3.39,P＜0.01],并维持至术后3周[(17.29±4.03),(11.25±5.01)分,t=3.89,P＜0.01;(65.77±8.06),(57.05±4.61)度,t=4.07,P＜0.01].②脊髓组织中人脐血干细胞的鉴定:假手术组、模型对照组脊髓组织中未见Brdu阳性表达区.干细胞移植组于移植后1周脊髓损伤区可见大量棕褐色Brdu阳性表达的人脐血间充质干细胞存在,并持续至移植后3周,而非损伤区则始终无阳性表达.结论:Brdu对脐血间充质干细胞具有良好的标记作用,经静脉移植的人脐血间充质干细胞能够进入脊髓损伤区,并可以促进损伤脊髓神经功能的修复.
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人脐血细胞静脉输注对血管性痴呆大鼠血清神经元特异性烯醇化酶及S-100蛋白的作用
目的:观察静脉输注人脐血细胞对血管性痴呆大鼠的行为学改善以及对血清脑特异性蛋白的影响.方法:实验于2003-03/2005-12在解放军第三军医大学野战外科研究所中心实验室完成.①选择2003-10/2004-12解放军第三军医大学大坪医院妇产科住院的80例健康足月妊娠产妇,非高危妊娠,正常顺产,新生儿四肢活动良好,由产妇及家属填写知情同意书,用于脐血的采集.②选取清洁级11～13个月的老龄SD大鼠90只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、人脐血细胞治疗组,30只/组.③模型对照组、人脐血细胞治疗组大鼠以改良的Pulsinelli's四血管阻断法建立血管性痴呆动物模型.假手术组处理步骤相同,但不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭.人脐血细胞治疗组在造模后3 h内通过尾静脉注射给予人脐血细胞,浓度为3×109 L-1,注射500μL.模型对照组、假手术组给予等量生理盐水.④各组大鼠分别于造模后2,4,8周采用电脑控制穿梭箱系统对大鼠学习记忆能力进行检测,10只/时相点.用ELISA法测定大鼠血清中神经元特异性烯醇化酶和S-100蛋白含量.结果:实验选取11～13月龄的SD大鼠90只,全部进入结果分析.①造模前后各组大鼠学习记忆能力检测结果:造模前各组大鼠主动回避反应百分率无明显差异(P＞0.05).造模后2,4,8周,模型对照组、人脐血细胞治疗组主动回避反应百分率均明显低于假手术组(P＜0.01);但人脐血细胞治疗组高于模型对照组(P＜0.01).②造模后各组大鼠血清神经元特异性烯醇化酶含量检测结果:与模型对照组比较,人脐血细胞治疗组术后2周血清神经元特异性烯醇化酶含量显著降低(P＜0.05),术后4,8周明显升高(P＜0.05).③造模后各组大鼠血清S-100蛋白含量检测结果:与模型对照组比较,人脐血细胞治疗组术后各时相点S-100蛋白血清含量均显著降低(P＜0.01),与假手术组基本相似(P＞0.05).结论:静脉输注人脐血细胞可明显改善血管性痴呆大鼠的行为学指标,提示人脐血细胞治疗对脑组织细胞具有一定的保护作用.
关键词： 痴呆 血管性 胎血/细胞学 磷酸丙酮酸水合酶/血液 S100蛋白质类/血液 -
人脐血间充质细胞体外分离培养方法及培养基特性
目的:采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质细胞的方法.方法:实验于2003-11/2004-10在郑州大学医学院干细胞中心完成.选择郑州大学医学院第三附属医院产科足月妊娠健康产妇的脐血用于实验(产妇均签署知情同意书),随机分为4组:低糖DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)组、高糖DMEM组、低糖DMEM+干细胞因子组、Msencult TM(一种特殊成分的液体培养基,与其添加物配合使用可促进间充质干细胞分化为脂肪细胞)组.待新生儿娩出后,立即断脐,消毒母侧脐带断端,60 mL无菌注射针穿刺脐静脉取血,立即导入肝素抗凝的无菌采血袋内.取新鲜采集的脐带血,用1.077 g/m3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,将脐血单个核细胞接种于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化.结果:①各组间充质细胞培养24h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较:Msencult TM组、低糖DMEM+干细胞因子组的贴壁细胞数明显多于高糖DMEM组、低糖DMEM组[(40.5±9.7),(31.5±4.2),(14.0±1.4),(7.5±1.6)个,P＜0.05],细胞存活率亦明显高于高糖DMEM组、低糖DMEM组[(97.1±0.9),(95.3±2.6),(84.1±1.9),(81.2±1.1)%,P＜0.05].②各组间充质细胞在不同培养时间下生长状态的比较:培养第3,7,10,14天Msencult TM组、低糖DMEM+干细胞因子组细胞增殖的速度均快于高糖DMEM组、低糖DMEM组(P＜0.05),且Msencult TM组细胞克隆数多[(1±1.22),(0.83±0.75),(0.2±0.4),0个,P＜0.05].结论:采用低糖DMEM+干细胞因子与单纯Mesencult TM培养基培养的细胞生长旺盛,但由于干细胞因子用量较大,价格昂贵,因此低糖DMEM联合应用干细胞因子的方法并不十分适用.而Mesencult TM为酸性培养基,有利于脐血细胞的生长,并可形成克隆,为脐血间充质细胞的成功培养创造了条件,是一种适合脐血间充质细胞生长的培养基.
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脐带血中血管内皮前期细胞的分离
目的:从脐带血中分离单个核细胞以获得血管内皮前期细胞,并观察其生物学行为.方法:用密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐带血中单个核细胞,种植在铺有纤维连接素的培养板中,3 d后去除未附着细胞,观察附着细胞的生长情况,采用免疫组化法进行鉴定.结果:单个核细胞培养3 d后可见大量的附着细胞和少量梭形细胞,梭形细胞数量在第7天时达到高峰.附着细胞对第八因子相关抗原呈阳性反应.结论:在纤维连接素上培养来源于脐带血的单个核细胞可获得血管内皮前期细胞.
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脐血CD34+细胞体外扩增及树突状细胞诱导的实验研究
目的研究脐血CD34+细胞在体外经造血细胞生长因子扩增后,诱导树突状细胞(DC)并观察该类DC在抗肿瘤免疫中的作用.方法 Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34+细胞,以干细胞因子、flt3配体、白细胞介素-3和红细胞生成素体外扩增2周,诱导DC生成,观察肿瘤抗原负载后诱导特异性细胞毒T淋巴细胞生成和对肿瘤细胞杀伤作用.结果 (1)脐血经免疫微磁珠法分离可获得高纯度的CD34+细胞;(2)2周体外扩增后,细胞数显著增加达150倍;体外集落试验证实该类细胞可形成粒单细胞集落形成单位/(CFU-GM);(3)扩增的细胞可成功诱导成DC,并具有活化异体淋巴细胞的功能,负载肿瘤抗原后能诱导产生肿瘤特异性淋巴细胞,并可特异性杀伤Daudi肿瘤细胞.结论脐血来源CD34+细胞在体外能成功地扩增,并诱导产生功能性DC.
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脐血造血干/祖细胞体外扩增后端粒酶活性的表达
目的探讨脐血造血干/祖细胞在不同细胞因子支持的体外扩增过程中端粒酶活性的表达及意义.方法应用PCR-ELISA方法检测脐血造血干/祖胞体外扩增前后的端粒酶活性、细胞扩增倍数及免疫表型的变化.结果新分离的脐血CD34+细胞表达弱的端粒酶活性,体外培养7 d,细胞端粒酶活性达高,干/祖细胞扩增倍数也明显增高,随着培养时间的延长,细胞分化成熟,端粒酶活性减低.结论端粒酶的活性的升高与造血干/祖细胞的扩增相一致;从临床应用价值来看,脐血CD34+细胞体外扩增时间应以7 d内为宜;IL-3促分化能力大于G-CSF.
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应用流式细胞仪对脐血细胞免疫学特点的检测
目的 研究脐血造血干/祖细胞和淋巴细胞的免疫学特点以及脐血干/祖细胞含量和细胞抗原特征对骨髓重建造血的影响.方法 收集34份脐血,用流式细胞仪双标法同时检测细胞表面的两种不同抗原.结果 34份脐血平均有核细胞数每份为(12.3±4.3)×108个,CD34+的绝对细胞数每份为(1.98±1.30)×107,其中CD34+ CD38+细胞占CD34+细胞的84.6%±9.1%;脐血淋巴样细胞群体中CD3+表达率为60.50%±11.80%,CD4+为38.66%±11.80%;CD8+为21.70%±6.37%,CD4+/CD8+比值是1.93±0.91;CD8+ CD45RA+细胞占CD8+细胞群体的98.93%±0.36%;CD4+ CD45RA+胞细胞占CD4+细胞的90.96%±6.96%.结论 脐血中干/祖细胞数量可以满足正常体重的成人脐血移植对干/祖细胞的需要.脐血中T淋巴细胞多为功能未成熟细胞,具有较小的抗原反应性,这有利于降低移植中移植物抗宿主反应.
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脐带血淋巴细胞染色体核型分析在孕中晚期胎儿染色体异常诊断中的作用研究
目的 评价脐带血淋巴细胞染色体核型分析在孕中晚期胎儿染色体异常诊断中的作用.方法 对临床有产前诊断指征的22 ～ 26周龄孕妇,在B超引导下经脐静脉穿刺抽取脐带血0.5～1 ml,分离外周血淋巴细胞,进行原代培养,收集生长状态良好的细胞,固定、制片、显带,进行染色体核型及数据分析.结果 在1 213例孕中晚期胎儿脐带血中成功培养外周血淋巴细胞1 211例,成功率99.9％.其中异常染色体142例,检出率达11.73％.包括非多态性染色体异常81例(检出率6.68％),多态性改变61例(检出率5.03％).非多态性染色体异常中染色体数目异常50例(占总异常数35.21％),包括嵌合体4例;染色体结构异常31例(占总异常数21.83％),其中11例易位,17例倒位,3例缺失.结论 基于脐带血淋巴细胞培养的染色体核型分析是孕中晚期产前异常染色体诊断的重要方法,对于减少染色体畸形儿的出生具有重要的意义.
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氯化高铁血红素对体外培养人脐静脉血内皮祖细胞数量和凋亡的影响
目的 体外观察不同浓度氯化高铁血红素(hemin)对人脐血来源的晚期内皮祖细胞(late EPCs)数量和凋亡的影响.方法 用密度梯度离心法分离提取人脐静脉血来源的单核细胞,在体外诱导分化为late EPCs.生长状态良好的第2～3代late EPCs随机接受不同浓度hemin(0、5、10、15、20 μmol/L)干预24 h后继续培养,台盼蓝染色法检测细胞活性,活细胞计数试剂盒检测细胞增殖情况,粘附试验测定观察细胞粘附能力,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 与对照组相比,较低浓度hemin(5μmol/L或10 μmol/L)可显著促进late EPCs的活性;当hemin浓度为5、10或15 μmol/L时,late EPCs增殖及粘附作用明显,而凋亡受到抑制.其中hemin浓度为10 μmol/L时这种作用强,而高浓度hemin(20μmol/L)则表现为相反的作用效果.此外,hemin促增殖、粘附及抑制凋亡的作用具有时间依赖性,在24 h作用强.结论 hemin在低浓度时显著增加了late EPCs的数量、促进粘附、抑制凋亡,在高浓度时则起相反作用.
关键词： 氯化血红素/药理学 胎血/细胞学 内皮细胞/药物作用/病理学 细胞凋亡 -
脐血多能干细胞免疫教育治疗青少年1型糖尿病
1型糖尿病(T1DM)是遗传易感因素与环境因素相互作用,主要由T细胞介导、多种免疫细胞参与反应,进而导致胰岛β细胞破坏和胰岛素缺乏的自身免疫性疾病.基础和临床研究发现,脐血多能干细胞通过细胞相互接触及分泌可溶性细胞因子,恢复T1DM患者的免疫平衡、诱导免疫耐受、阻止胰岛β细胞损伤和促进胰岛β细胞再生.近年来,本中心率先开展了脐血多能干细胞教育治疗35例来自国内外的青少年T1DM的临床研究,期望能为其治疗提供新手段.
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人脐血间充质干细胞抑制异体T淋巴细胞反应的实验及临床意义
目的:研究人脐血间充质干细胞(MSCs)对异体外周血T淋巴细胞抑制的影响.方法:分离、扩增脐血MSCs,流式细胞术检测表面标志以鉴定.取分离培养的脐血MSCs,与经分离的异体淋巴细胞共培养,在植物血凝素(PHA)刺激下,用MTT还原法测定细胞增殖,观察脐血MSCs对PHA刺激的T淋巴细胞转化抑制作用.采用ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平.结果:脐血MSCs在PHA刺激下可抑制T淋巴细胞增殖,且其培养上清也具有抑制异体淋巴细胞增殖转化能力.ELISA检测7 d共培养上清中IFN-γ和IL-4两种细胞因子的含量,发现IFN-γ分泌水平下调、IL-4分泌水平部分上调.结论:脐血MSCs具有抑制异体淋巴细胞免疫反应,降低移植物抗宿主反应(GVHD)的作用.具有研究价值和应用潜能.
