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NK细胞表面CD160分子表达及其介导NK杀伤效应机制的初步研究
目的:研究CD160分子在人自然杀伤(NK)细胞中的表达及与血液肿瘤的可能关系.方法:从RNA和蛋白水平确定人白血病细胞系NK92细胞表达CD160,并检测该细胞系的增殖特征及细胞表面分子的表达特点.建立以NK92为效应细胞、人白血病细胞系K562或THP-1为靶细胞的杀伤反应体系.加入CD160阻断抗体CL1-R2后,明确其对NK92细胞杀伤功能的影响.同时,采用流式细胞术检测不同种类初发血液肿瘤患者的外周血标本中NK细胞的CD160表达水平.结果:RT-PCR及Western blot杂交检测到NK92表达CD160,流式细胞学检测到NK92细胞表面CD160表达强阳性.NK92可有效杀伤2种白血病靶细胞,抗体阻断CD160后,NK92的杀伤功能被显著抑制.2种靶细胞均高表达HVEM,而K562不表达HLA I类分子.不同种类血液肿瘤患者的外周血CD3-CD56+ NK细胞CD160表达均低于正常对照细胞.其中急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)受者组与正常对照之间有显著性差异(P＜0.05).结论:人CD160分子参与并介导了NK细胞的部分杀伤功能,血液肿瘤患者NK细胞表面CD160分子表达存在不同程度的下降,提示CD160表达的下调可能是血液系统肿瘤免疫逃逸的一种新机制.
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HIV感染无症状者外周血中HIV特异性T细胞及其亚群表达CD160情况的研究
目的 探讨HIV感染无症状者外周血中CD160在HIV特异性T细胞及其各亚群中的表达情况.方法 采集2014年6月至2015年11月于解放军第302医院就诊的43例未经抗病毒治疗的HIV感染无症状者和18例健康者的外周血,分离外周血单个核细胞,用免疫荧光染色法标记CD160后,以流式细胞仪检测其在HIV特异性T细胞及其各亚群(Tn、Tcm、Tem和Teff)细胞上的表达情况.结果 HIV感染无症状者外周血中,CD160在总体HIV特异性CD4 +T细胞和CD8+T细胞中表达的频数和MFI均较健康对照组高(P＜0.01);HIV特异性CD4+T细胞的各亚群中,CD160在CD4+ Tn细胞中MFI,CD4+ Teff细胞中频数和MFI显著升高(P＜0.01);HIV特异性CD8+T细胞的各亚群中,CD8+ Tn细胞、CD8 +Tcm细胞及CD8+ Tem细胞表达CD160的频数和MFI均显著升高(P＜0.01).结论 慢性HIV感染可导致HIV特异性T细胞及其不同亚群中CD160高表达,引起细胞免疫功能紊乱,可能进而损伤了对HIV病毒的控制能力.
关键词： 人获得性免疫缺陷病毒 CD160 CD4+T细胞 CD8+T细胞 -
CD160在慢性淋巴细胞白血病中的生物学特征研究
目的 探讨CD160在慢性淋巴细胞白血病中的表达及临床意义.方法 应用流式细胞仪检测22名健康对照者、91例CLL患者、76例B细胞非霍奇金淋巴瘤CD160的表达.同时检测91例CLL患者和22名对照者PTEN、p-Akt的表达.结果 22名健康对照1例(4.5％)CD160呈弱阳性.91例CLL患者89例(97.80％) CD160阳性,远高于对照组,差异有统计学意义(x2=89.38,P＜0.01).CLL患者PTEN蛋白较对照组表达明显减低,p-Akt表达较对照组显著增高,且CLL患者CD160表达水平与p-Akt表达水平呈正相关,而与PTEN表达水平呈负相关.76例淋巴瘤患者5例(6.58％) CD160阳性,分别为4例HCL,1例SMZL.48例MCL患者CD160均阴性.CD160在CLL中的阳性率远高于淋巴瘤,差异有统计学意义(x2=140.06,P＜0.01).CLL与MCL免疫表型差异主要是CD23与FMC7的阳性率不同,CD160在CLL中的阳性率远高于MCL,差异有统计学意义(x2=130.51,P＜0.01).四格表诊断性试验分析显示,CD160在CLL中的敏感度为97.80％,特异性为90.79％,准确度为94.61％.CD160在CLL患者高表达与临床预后无关.结论 CD160在CLL细胞中普遍高表达,有助于CLL的诊断和鉴别诊断.
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人CD160基因转染细胞株的建立及其生物学特性的研究
目的 克隆人CD160基因,并构建含有该目的基因的pIRES2 - EGFP重组质粒载体,获得稳定表达CD160分子的基因转染细胞.方法 从人外周血cDNA文库中扩增CD160的基因,另以VSIG4基因的cDNA为模板扩增跨膜区基因片段,将它们一并装入pIRES2 - EGFP质粒载体中,脂质体法共转染L929细胞,用G418筛选出能稳定表达CD160分子的L929细胞株.结果 成功克隆出了CD160的基因,构建了pIRES2 - EGFP/CD160TMv质粒载体,并建立了稳定表达人CD160分子的L929转基因细胞株,该转基因细胞能结合L929/HVEM转基因细胞,证明其功能性.结论 构建了含人CD160基因的重组pIRES2-EGFP质粒载体和建立稳定表达人CD160分子的细胞株,为CD160分子的后续研究奠定基础.
关键词： CD160 pIRES2-EGFP 基因转染 L929细胞 -
可溶性CD160分子对荷瘤小鼠CD4+T细胞免疫活性的调节作用
目的 观察CD160胞外段(即可溶性CD160分子)对荷瘤小鼠CD4+T淋巴细胞的活性和免疫功能的影响.方法 构建小鼠CD160分子胞外段(sCD160)的重组表达载体psCD160,转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,Western blot检测培养上清中的sCD160水平.建立TC-1宫颈癌细胞荷瘤小鼠模型,流式细胞术(FCM)检测CD160在脾CD4+T细胞上的表达;免疫磁珠分选荷瘤3周小鼠脾CD4+T细胞,与负载肿瘤细胞抗原肽复合物的树突状细胞(DC)共培养6d,FCM检测CD4+T细胞上CD160的表达.负载抗原肽复合物的DC分别在转染pcDNA3.1或psCD160的CHO培养上清中孵育18h后,与分选的CD4+T细胞共培养6d,羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记法检测CD4+T细胞增殖,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养上清中白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)的浓度.结果 转染psCD160的CHO细胞表达并分泌可溶性CD160分子.荷瘤3周小鼠CD4+T细胞上CD160分子的阳性率与对照组比较差异无统计学意义[(5.288±2.723)％比(3.213±1.461)％,P＞0.05],在体外被负载特异性抗原肽复合物的DC再活化后,其CD160阳性率显著增高达(17.590±7.287)％(P＜0.05).与未经sCD160作用的DC组相比,经sCD160封闭的负载特异性抗原肽复合物的DC再活化的CD4+T细胞中增殖细胞百分数[(17.980 ±5.337)％比(12.610 ±4.431)％,P＜0.05]、上清中的IL-2和IFN-γ浓度[(383.9±83.67) ng/L比(237.5±54.64) ng/L,(730.8±135.8) ng/L比(451.9±149.5) ng/L,P＜0.05]均显著升高.结论 肿瘤特异性CD4+T细胞在体外再活化后CD160的表达升高,可溶性CD160阻断其作用可有效增强CD4+T细胞增殖和细胞因子分泌的活性.
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CD160的表达与荷瘤小鼠CD8+T细胞免疫活性的关系
目的 探讨CD160分子在荷瘤小鼠CD8+T淋巴细胞上的表达及其对CD8+T细胞活性和免疫功能的影响.方法 C57BL/6小鼠接种TC-1宫颈癌细胞建立小鼠荷瘤模型,免疫磁珠分选小鼠脾脏细胞获得CD8+T细胞,流式细胞术检测CD160在CD8+T细胞上的表达;流式细胞仪(FACS)分选CD8+T细胞获得CD160+ CD8+T细胞群和CD160-CD8+T细胞群,将两群细胞分别与肿瘤细胞抗原肽热休克蛋白70 (HSP70)-TC-1复合物和去除CD8+T的脾细胞混合,两群混合细胞各分为两组,其中一组同时加入CD160高亲和力配体单纯疱疹病毒侵入介导子(HVEM)的抗体,刺激培养6d,羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记法检测CD8+T细胞增殖,流式细胞术检测各组细胞胞内穿孔素和γ-干扰素(IFN-γ)的表达.结果 荷瘤3周,小鼠CD8+T细胞上CD160分子的阳性率为(18.050 ±7.944)％,显著高于对照小鼠的阳性率[(8.663 ±3.921)％,P＜0.01];刺激培养后,CD160+ CD8+T细胞群中增殖细胞比例为(3.425 ±2.352)％,显著低于CD160-CD8+T细胞群的(15.440±6.673)％ (P＜0.01),抗HVEM抗体阻断CD160与HVEM的相互作用后,CD160+ CD8+T细胞群中增殖细胞比例显著增高达到(12.000 ±5.286)％ (P ＜0.01);同时,CD160+CD8+T细胞群中表达穿孔素和IFN-γ的阳性细胞率分别为(5.263±2.752)％和(4.150±2.499)％,显著低于CD160-CD8+T细胞群的(17.600±7.203)％和(11.480 ±4.790)％ (P＜0.01),抗HVEM抗体的作用使CD160+ CD8+T细胞群中表达穿孔素和IFN-γ的阳性细胞率显著增高,分别达到(12.380±4.922)％和(11.280 ±4.037)％ (P ＜0.01).结论 CD160在荷瘤小鼠的脾CD8+T细胞上表达升高且与其免疫活性功能的下降有关;阻断CD160和HVEM的相互作用,部分逆转了CD8+T细胞的免疫活性的抑制.
关键词： CD160 单纯疱疹病毒侵入介导子 CD8+T细胞 穿孔素 γ-干扰素 -
小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达
目的 构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力.结果 获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确.用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后.RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合.结论 成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础.
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CD160在 EB 病毒感染患儿 T 淋巴细胞上的表达及临床意义
目的：探讨共抑制分子CD160在EB病毒感染患儿外周血CD8＋ T淋巴细胞上的表达及临床意义。方法选取2013年1月～2014年12月在武汉市妇女儿童医疗保健中心就诊的急性EB病毒感染患儿、慢性EB病毒感染患儿和同期健康对照儿童各27例。酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清EB病毒特异性抗体，实时荧光聚合酶链反应法（Real‐time PCR）定量检测外周血淋巴细胞EBV‐DNA ，流式细胞仪检测外周血CD4＋、CD8＋ T细胞亚群比例以及共抑制分子CD160、PD‐1和2B4在CD8＋ T细胞上的表达率，并将CD160、2B4的表达率与外周血病毒载量行相关性分析。结果急性感染患儿外周血淋巴细胞CD4＋／CD8＋比值急剧降低，慢性感染患儿该比值有所恢复；与对照组相比，共抑制分子CD160和2B4在慢性感染患儿外周血CD8＋ T细胞上的表达明显增高（ P＜0.05），而在急性感染患儿中的表达无明显变化，PD‐1在急、慢性感染患儿中的表达均无明显变化；CD160在CD8＋ T 细胞上的表达率与患儿外周血EB病毒载量呈正相关（ r＝0.4458，P＜0.05），而2B4的表达率与病毒载量无明显相关性。结论 CD160在慢性EB病毒感染患儿外周血CD8＋ T细胞上的表达上调，且与外周血EB病毒DNA载量呈正相关。
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CD160在慢性淋巴细胞白血病中的表达及临床意义
目的:探讨CD160在B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)中的表达及意义.方法:用多参数流式细胞仪检测45例初诊CLL患者骨髓和38例非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者浸润骨髓CD19+细胞CD160表达阳性率.10例健康人骨髓CD19+细胞作为对照.FCM检测患者CD19+细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达平均荧光强度(MFI).统计学分析CLL细胞CD160与CD5、CD23和Bcl-2表达MFI的相互关系.结果:45例初诊CLL中,41例表达CD160阳性的患者同时表达CD5+、CD23+,4例CD160阴性患者表达CD5+、CD23dim.4例初诊CLL,经过细胞遗传学检查和免疫病理学检查确诊为套细胞淋巴瘤(MCL).38例NHL中,有5例CD160表达阳性.10例健康对照CD160均为阴性.CD160表达阳性率在41例CLL为(69.94 ± 19.69)%,明显高于NHL(43.63 ± 17.38)%(t = 2.47,P ＜ 0.05).41例CLL患者CD160阳性率与CD5+CD23+双阳性率[(76.03 ± 15.76)]%有明显相关性(r = 0.857 1,P ＜ 0.01).41例CLL患者高表达抗凋亡蛋白Bcl-2,MFI为138.23 ± 54.99.41例CLL细胞计数绝对值与抗凋亡蛋白Bcl-2表达有明显相关性(r = 0.738 1,P ＜ 0.05).4例确诊为MCL患者抗凋亡蛋白Bcl-2表达无明显异常.结论:CLL患者CD160高表达.CD19+CD160+可以作为鉴别良恶B淋巴细胞特异性的指标.用FCM检测细胞膜CD19、CD160、CD5、CD23等抗原表达情况,对于CLL的诊断和与其他B淋巴细胞增殖性疾病的鉴别有重要的价值.
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Herpes virus entry mediator/CD160介导入调节性T细胞对CD4+效应性T细胞的抑制作用
目的 研究HVEM、CD160在不同CIM+ T细胞亚群,不同功能状态下的表达以及HVEM-CD160通路对CD4+ CD25+ 调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)免疫调节作用的影响.方法 采用流式细胞分析术分别检测3例不同个体CD4+ CD25+ Tregs及CD4+ CD25-T 细胞在1 000 IU/ml人重组IL-2、与细胞数量1∶1的抗CD3/CD28 mAb包被磁珠的刺激下第0、3、5天HVEM或CD160的表达情况.采用1.25、2.5、5μg/ml HSV1 gD蛋白处理4例不同个体Treg,培养5 d后,将处理的Treg与Teff在体外以1∶1混合并加入300 IU/ml IL-2及等量抗CD3/CD28 mAb包被磁珠,行混合淋巴细胞共培养,于培养结束前18 h加入3H-TdR,共培养7 d后检测各组细胞CPM增殖情况.5 μg/ml gD蛋白处理5例不同个体Treg后将其细胞浓度调整为5×106并接种于6孔培养板内,加入500 IU/ml IL-2共培养7 d,行RT-PCR(Realtime PCR)分析Treg Foxp3基因表达.结果 HVEM在初始CD4+ CD25+ Tregs表面呈中度表达,平均表达率为42%,且随着Treg的活化其表达HVEM上调;CD160在初始CD4+ CD25-T细胞表面呈低度表达,平均表达率仅7%,但伴随其活化,表达CD160有所上调.采用不同浓度HSV1 gD蛋白处理Treg后2.5 μg/ml与5μg/ml浓度组抑制CD4+ CD25-T细胞增殖作用与空白对照组(276±35)相比明显下降,CPM值分别为(2014±202)、(6535±531),差异具有统计学意义(P＜0.05),且具有浓度依赖性;RT-PCR分析发现Treg经5μg/ml gD蛋白处理后Foxp3基因表达率下降,仅为空白对照组的48%,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 机体接受免疫刺激后Treg通过上调HVEM表达与CD4+ CD25-效应性T细胞(effective T cell,Teff)表面上调表达的受体CD160交联从而上调Treg Foxp3基因的表达,终介导了Treg对Teff活化、增殖的抑制作用,HVEM-CD160通路对Treg免疫调节作用具有重要意义.
