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rAd-DKK1-shRNA表达载体的构建
目的 筛选构建针对骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)的小干扰RNA(shRNA)腺病毒载体.方法 根据shRNA靶位点的选择原则,从TRCshRNA数据库及Ambion shRNA数据库中择优选取3条DKK1 shRNA序列,通过DKK1构建过表达载体,筛选出佳干扰序列,体外同源重组构建DKK1-shRNA腺病毒表达载体,经酶切、PCR鉴定、测序.结果 成功构建pYr-1.1-DKK1-shRNA-153、pYr-1.1-DKK 1-shRNA-155、pYr-1.1-DKK1-shRNA-Am表达载体,分别通过RT-PCR与Western印迹检测DKK1的表达,结果显示pYr-1.1-DKK 1-shRNA-153为佳干扰序列.结论 成功构建了针对BMSC的小干扰RNA(shRNA)腺病毒载体,为后续靶向目的基因的实验研究提供了依据.
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DKK1蛋白在兔下颌骨牵引成骨过程的表达及其意义
目的 探讨下颌骨牵引成骨(MDO)过程Wnt/β-catenin信号通路拮抗剂DKK1蛋白的表达及意义.方法 将健康成年新西兰大白兔24只分为牵引组和对照组,每组12只.牵引组行双侧下颌骨截骨后放置牵引器.对照组行双侧下颌骨截骨后直接牵开5 mm,钛板钛钉固定.细胞图像分析仪测量骨痂DKK1的表达.结果 免疫组织化学染色显示,DKK1主要定位于骨痂组织的成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞胞质中.牵引组随着牵引启动DKK1表达逐渐增加,在术后第10天时达高峰,随着牵引张力消失,术后17～24 d表达减弱,术后31～38 d,骨细胞内DKK1表达逐渐降低,胞核、胞质染色均为阳性.在各时间点,牵引组DKK1表达均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 牵引成骨过程中,随着牵引应力激活Wnt/β-catenin信号通路,通路相关蛋白表达增强,其负性调控因子DKK1表达也随之增强,有利于牵引区新骨生成和改建重塑.
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非小细胞肺癌患者血清DKK1蛋白表达及其与骨转移的关系
目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中Wnt通路抑制因子DKK1蛋白的表达水平及其与骨转移的关系.方法 应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测33例有骨转移、41例无骨转移NSCLC患者及32名健康体检者血清中DKK1蛋白的表达水平采用方差分析和独立样本t检验比较其差异.DKK1表达和骨转移之间相关性的分析采用Pearson相关分析法.结果 NSCLC患者血清中DKK1蛋白表达水平为(79.6±8.3)ng/ml,高于健康体检者的(21.5±6.4)ng/ml,两者差异有统计学意义(t=13.17,P=0.001).NSCLC患者中有骨转移组DKK1蛋白表达水平为(110.3±11.4)ng/ml,高于无骨转移组的(60.7±10.5)ng/ml,两组差异有统计学意义(t=14.128,P=0.003).血清DKK1水平与NSCLC骨转移之间呈正相关(r=0.855,P<0.001).结论 NSCLC患者血清中DKK1蛋白的表达水平与骨转移关系密切.DKK1有望成为预测NSCLC有无骨转移的生物学指标.
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壮骨止痛方提取物对去势雌鼠Dkk1蛋白的影响
目的:观察壮骨止痛方提取物对去势大鼠Dkk1蛋白的影响,并探究其治疗骨质疏松症的具体机制.方法:60只3月龄的健康雌性SD大鼠,随机分为壮骨止痛方组、模型组、假手术组、空白组,每组15只.壮骨止痛方组、模型组去势(去卵巢)后建立绝经后骨质疏松大鼠模型,假手术组去除卵巢周围相应体积脂肪.术后5d开始给药,13周后取血和骨组织,测定血清中雌激素(E2)、降钙素(CT)、骨钙素(BGP)含量变化、骨组织病理变化、骨小梁密度,以及骨组织中Dkk1、β-catenin蛋白的表达情况.结果:与模型组相比,壮骨止痛方能降低去势雌鼠血清BGP、CT含量,差异具有统计学意义(P＜0.05);壮骨止痛方组E2与模型组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05).壮骨止痛方组相比模型组,骨髓腔扩大不明显,且骨小梁形态较为正常;与模型组相比,壮骨止痛方组骨小梁密度有明显升高,具有显著性(P＜0.05);与模型组比较,壮骨止痛方组骨组织中骨组织Dkk1蛋白的表达降低、而β-catenin蛋白的表达增多,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:壮骨止痛方可能是通过下调去势雌鼠体内Dkk1蛋白表达,进一步直接影响β-catenin的表达,间接影响雌激素、降钙素等激素的变化,从而达到改善骨代谢紊乱来治疗骨质疏松症.
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DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯及其预后的相关性研究
目的 探讨DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯及其预后的相关性.方法 选择2005年1月-2012年12月来我院行切除治疗肝内胆管癌患者78例,制作肝内胆管细胞癌组织及癌旁组织的组织芯片,并于术前进行生化指标测定.患者术后每隔3个月复查1次,并结合患者的临床资料和病历资料,采用Kaplan-Meier法进行无复发生存曲线及总生存曲线的绘制,采用Cox比例风险回归模型进行多因素分析,确定影响预后无复发生存时间(Relapse-free survival,RFS)和总生存时间(O-verall survival,OS)的因素.结果 DKK1蛋白表达阴性与表达阳性的患者间GGT、肝门淋巴结侵犯、Child-Pugh分级、MMP9差异存在统计学意义(P＜0.05).78例肝内胆管细胞癌患者组织芯片结果发现DKK1蛋白在肝内胆管细胞癌的阳性表达率为35.90％(28/78),在癌旁组织中的阳性表达率为14.10％(11/78).78例肝内胆管细胞癌患者的1、3、5年的总生存率和无复发生存率分别为51.28％(40/78)与50.00％(38/78)、41.03％(32/78)与38.46％(30/78)、25.64％(20/78)与23.08％(18/78).相关危险性因素经单因素、多因素分析后,研究结果显示GGT、CA19-9、CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者RFS的预后因素;CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者DFS的预后因素.DKK1蛋白表达阳性与阴性的OS与RFS曲线显示,5年后肝内胆管细胞癌患者DKK1蛋白表达阳性与阴性的总生存率分别为28.20％与20.51％;无复发生存率分别为24.36％与21.79％.结论 肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯与否与DKK1蛋白表达密切相关,DKK1蛋白表达可能是影响肝内胆管细胞癌患者OS和RFS的预后因素.
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Wnt/β-catenin信号通路在双酚A暴露对子鼠雄性生殖细胞表达
目的 探讨Wnt/β-catenin信号通路蛋白在出生前后双酚A(BPA)暴露对子鼠雄性生殖表达.方法 ICR孕鼠饮水染毒,自受孕0天随机分为:溶剂对照组、100 nmol/LBPA组、300nmol/LBPA组;雄性仔鼠出生后6周处死,取睾丸组织,免疫组化检测β-catenin、DKK1蛋白的表达.结果 免疫组化结果显示,与溶剂对照组比较,BPA暴露组β-catenin、DKK1蛋白表达明显增加,多分布在精原细胞和睾丸间质细胞中,且间质细胞强阳性.结论 Wnt/β-catenin信号通路蛋白可能参与了BPA暴露对子鼠雄性生殖细胞表达影响.
关键词： 双酚A 睾丸生殖细胞 β-catenin蛋白 DKK1蛋白 -
人源Dickkopf1原核表达产物对体外培养的黑素细胞的抑制作用
目的:观察人源Dickkopf1原核表达产物(DKK1蛋白)对体外培养的黑素细胞的抑制作用.方法:采用MTT法测定细胞增殖情况;光学显微镜观察细胞形态学变化;氢氧化钠裂解法测定黑素合成;多巴氧化法测定酪氨酸酶活性.结果:DKK1蛋白对黑素细胞的增殖有抑制作用,能使细胞数明显减少(P＜0.05);光学显微镜观察到DKK1蛋白作用的黑素细胞胞体较大,形态略呈多角形,树突较粗短;并能使黑素合成显著下降(P＜0.05);使酪氨酸酶活性显著减弱(P＜0.05).结论:DKK1蛋白能抑制黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性,为DKK1蛋白应用于治疗色素增多性疾病奠定实验基础.
