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胎儿海马神经干细胞的体外培养及神经元前体细胞的纯化
目的从人胎儿海马分离培养具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞,并从中纯化神经元前体细胞. 方法利用无血清培养从胚胎4个月的胎儿海马区分离细胞,并在体外连续传代培养;采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达、经BrdU 孵育后的BrdU表达;比较两种诱导分化方法所获得的神经元和胶质细胞的比例差异;利用单细胞克隆技术纯化神经元前体细胞. 结果分离的细胞具有连续克隆能力,在体外培养了16个月,传了43代 ;细胞冻存、复苏后仍保持干细胞特性;培养的细胞呈Nestin阳性,在BrdU孵育后呈BrdU阳性,诱导分化后的细胞能够表达Tubulin、NeuN或GFAP;利用无血清诱导所得到的分化细胞中神经元的比例约占80%,而血清诱导的分化细胞中胶质细胞的比例则大于90%.利用单细胞克隆技术可从神经球中纯化的细胞表达Nestin,并且全部分化成神经元. 结论从胎儿海马区分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞,从中可纯化出神经元前体细胞.
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正常成年大鼠神经元前体细胞的迁移
目的 探讨正常成年大鼠脑中神经元前体细胞的迁移路径和迁移特征,为病理状况下的神经元迁移研究提供理论和实验基础.方法 将成年大鼠脑组织按冠状位和矢状位行冰冻切片(片厚20 μm),采用免疫组织化学染色技术观察Doublecortin(DCX)免疫阳性细胞的迁移路径以及DCX阳性细胞的迁移特征.结果 正常成年大鼠神经元前体细胞的迁移主要有两条路径:一条是从室下区到嗅球的吻侧迁移流,另一条是位于皮层和胼胝体之间的胼胝体周围迁移流.吻侧迁移流中的DCX免疫阳性细胞较规则的有序排列,形态上呈梭形的胞体和单个较长的前导突起,前导突起基本朝向嗅球,细胞大小基本一致:而胼胝体周围迁移流中的DCX免疫阳性细胞胞体呈类圆形,突起的大小、数目和方向多样.结论 研究神经元前体细胞的迁移不仅有助于明确其迁移的具体机制,而且有助于控制神经元的迁移和设计有效的治疗策略.
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成年大鼠局灶性脑缺血对颗粒下层区神经元前体细胞增殖的影响
目的 探讨成年大鼠局灶性脑缺血后齿状回颗粒下层(SGZ)神经元前体细胞的增殖改变.方法 大脑中动脉栓塞再灌注(MCAO/R),术后第1天、第2天腹腔注射Brdu,第3天、7天、14天和28天取脑,每个时间组6只SD大鼠,冷冻切片,免疫荧光三标检测SGZ区5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)、DCX、ki67、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及CNP的表达.结果 (1)MCAO/R后,SGZ区增殖细胞聚集成簇,细胞簇计数从3d开始增加,7d时多,随后下降;(2)细胞簇内细胞计数从3d开始增加,7d时多,随后下降;(3)细胞簇中ki67(+)细胞比例从3d开始到28d逐渐下降.结论 MCAO/R引发SGZ区神经元前体细胞经多次分裂以成簇方式增殖,部分子代细胞向神经元分化,部分子代细胞仍保持增殖能力.
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无血清培养条件下神经元前体细胞的增殖
目的:建立新生大鼠大脑皮层细胞原代培养体系并进行神经元前体细胞的增殖研究.方法:原代混合培养新生大鼠大脑皮层细胞;混合培养体系用血清培养基培养6 d后换用无血清培养基培养,免疫细胞化学显色鉴定此培养过程中不同时间点的细胞类型,并在不同时间段加入 BrdU,用于分析神经元前体细胞的增殖状况.结果:换用无血清培养基培养后,出现明显的细胞分层现象;神经元及其前体细胞的比例逐渐上升,而神经干细胞和星形胶质细胞的比例缓慢下降;增殖细胞的比例在0～24 h、24～48 h、48～72 h时间段里逐渐增加,而在72～96 h、96～120 h时间段里逐渐减少.结论:新生大鼠大脑皮层细胞混合培养体系在无血清培养条件下促进神经元前体细胞的增殖.
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微管相关蛋白Doublecortin在成年大鼠神经元前体细胞发生中的表达
目的:探索神经元前体细胞的微管相关蛋白Doublecortin(DCX)在成年大鼠神经元前体细胞发生中的表达,为神经元前体细胞的增殖和迁移研究提供理论及实验基础.方法:将大鼠脑组织行冰冻切片,采用免疫组化在光镜下观察DCX免疫阳性细胞的表达部位和形态特点.结果:神经元前体细胞的标志物DCX主要分布在4个神经发生相关区域:室下区、齿状回的粒下层、吻侧迁移流和嗅球.然而在皮质等无神经发生的区域只有极少量的DCX免疫阳性细胞.DCX免疫阳性细胞在形态上均呈梭形的胞体和单个的前导突起.结论:DCX免疫阳性细胞的形态符合神经元前体细胞的形态特征.DCX作为神经元前体细胞的标志物可以用来研究神经元前体细胞的增殖和迁移.
关键词： Doublecortin 神经元前体细胞 细胞增殖 迁移 -
GDNF对PD模型大鼠黑质神经祖细胞和神经元前体细胞增殖及分化的影响
目的探讨胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)对帕金森病(PD)模型大鼠黑质内神经祖细胞和神经元前体细胞增殖和分化的影响.方法大鼠右侧纹状体内注射6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)建立模型,行为学分析筛选PD动物模型.将动物模型分为4组:动物模型对照组(右侧黑质内不注射);PBS组(右侧黑质内注射PBS);GDNF组(右侧黑质内注射GDNF);EGF+GDNF组(右侧黑质内注射EGF+GDNF).动物继续存活21天.免疫组织化学染色方法检测黑质内酪氨酸羟化酶(TH)、Ⅲ型β-微管蛋白(Tuj1)、巢蛋白(Nestin)免疫反应阳性细胞,光镜下观察并进行细胞计数,统计学分析处理数据.用Western blot方法分析黑质TH、Tuj1、Nestin蛋白的表达,蛋白条带用图象处理仪扫描,用LabWorks软件分析处理.结果在GDNF组及EGF+GDNF组大鼠出现显著的行为学功能恢复的同时,其TH反应阳性神经元数量和TH蛋白表达均显著高于对照组,且能同时检测到这里有Tuj1反应阳性细胞及Tuj1蛋白表达.但仅在EGF+GDNF组检测到Nestin反应阳性细胞及Nestin蛋白表达.结论 GDNF能促进PD模型大鼠黑质内神经元前体细胞向多巴胺能神经元方向分化.
关键词： 帕金森病 黑质 神经祖细胞 神经元前体细胞 胶质细胞系源性神经营养因子 -
成年大鼠局灶性脑梗死后齿状回神经元前体细胞的发生研究
目的初步探讨脑缺血后神经元前体细胞的发生机制.方法建立一侧大脑中动脉缺血再灌注模型,应用神经元前体细胞的标志物DCX(Doublecortin)检测缺血再灌注后不同时相点海马齿状回神经元前体细胞的增殖情况.结果再灌注后第7天梗死侧及非梗死侧齿状回DCX阳性细胞数达到高峰,与相应假手术组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);同时各个时相点梗死侧与非梗死侧比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);再灌注后第21天双侧齿状回DCX阳性细胞数基本恢复至正常水平.结论局灶性脑缺血可以诱导成年大鼠神经元前体细胞的发生,这对于脑缺血后的神经修复可能起关键性作用;其机制可能是缺血区域产生的一些神经发生调节因子弥散到神经发生区域所致.
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成年大鼠局灶性脑梗死后神经元前体细胞的迁移研究
目的探讨成年大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注后梗死灶周神经元前体细胞的迁移特征. 方法建立一侧大脑中动脉栓塞缺血再灌注模型,应用免疫组化及细胞记数检测缺血再灌注后1、7、14、21 d梗死灶周神经元前体细胞的变化. 结果各个时相点的梗死灶周均可见神经元前体细胞;在缺血再灌注后第7天阳性细胞的数量达到高峰,随后逐渐下降;但在梗死区域的镜像区域未见到阳性细胞的表达. 结论成年大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注可激活神经元前体细胞的发生,并诱导神经元前体细胞朝着梗死区域迁移.
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导向因子在神经元前体细胞迁移中的作用
神经元前体细胞(neuronal precursors)迁移是中枢神经系统正常发育过程必经阶段;神经元前体细胞脑内移植后可在全脑迁移;在有病变的中枢神经系统修复过程中,神经元前体细胞的迁移具有损伤区靶向性.是何机制导致神经元前体细胞长距离定向迁移呢? 研究发现迁移可能和长距离导向机制、细胞内信号、前体细胞移动机制以及迁移微环境均有密切关系.目前发现涉及导向机制的导向因子主要有netrins、Slits、Semaphorins和Ephrins.下面就这些导向因子在神经元前体细胞迁移中的作用进行综述.
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离体培养的生后大鼠脑室下层神经元前体细胞免疫细胞化学和形态学研究
为了探讨生后大鼠脑室下层神经元前体细胞离体培养时的神经活性物质特征和形态学特征，本研究以细胞特异性的抗体进行免疫细胞化学反应并测量了这些细胞的形态学指标——胞体平均直径和胞体椭圆率(胞体小径与大径的比值)。取脑室下层细胞接种于覆有多聚赖氨酸的24孔培养板，培养液为NeurobasalMedium(Gibco)／B27，培养条件为5％ CO2，37 C。结果如下：在培养1 d时，绝大多数(大于90％)脑室下层源细胞呈β-3型微管蛋白阳性，且这些细胞也都表达多唾液酸神经粘连分子。此时，大多数β-3型微管蛋白阳性细胞胞体呈椭圆形(胞体平均直径为8.42±1.03μm；胞体椭圆率为0.57±0.12)，且在其两极各长出一短的、无分支的突起；并有近20％者为球形无突起细胞(胞体平均直径为7.20±1.04 μm)，且它们大多呈细胞与细胞相连接状态。随着培养时间的延长，这些细胞亦呈上述椭圆形有突起样细胞变化，但仍可见它们呈串珠样连接。培养至第3～5 d，这些脑室下层源细胞的体积增大(胞体平均直径为9.07±1.07 μm)、突起较前增长但仍几无分支。免疫细胞化学反应显示，此时培养中的脑室下层源细胞仍大多呈β-3型微管蛋白阳性和多唾液酸神经粘连分子阳性。至培养的第7 d，这些β-3型微管蛋白阳性的脑室下层源细胞表现出显著的形态学变化，呈典型的神经细胞表型，其胞体继续增大(胞体平均直径为12.8±1.13μm)，突起更长且分支明显。本实验结果提示，在出生后大鼠脑室下层确含有神经元前体细胞，且其在离体条件下仍呈多唾液酸神经粘连分子阳性，并能分化为新的神经细胞。
