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乏氧对肺癌细胞系HIF家族成员HIF-1α、HIF-2α和HIF-β表达的影响及其相关性
目的 探讨乏氧对不同类型肺癌细胞乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)、乏氧诱导因子-2α(HIF-2α)和乏氧诱导因子-β(HIF-β)基因表达的影响及其相关性. 方法 以0.5%低氧培养箱模拟细胞低氧环境,采用定RT-PCR和Western blotting方法 分别检测乏氧处理4～24h人肺癌细胞系SPCA1、A549、H446、SH77、H520和95D中HIF-1α、HIF-2α和HIF-βmRNA和蛋白水平的表达. 结果 1.常氧下不同肺癌细胞系HIF-1α、HIF-2α mRNA表达水平较低,短期乏氧HIF-1α mRNA降低而HIF-2α mRNA增加,随乏氧时间延长两者mRNA表达逐渐增加.2.HIF-1α和HIF-2α蛋白在常氧下表达均较低,乏氧下两者表达增强但变化趋势不一致,HIF-1α蛋白在所有细胞中均有表达,HIF-2α蛋白仅在某些细胞有表达.3.HIF-β mRNA和蛋白在常氧或乏氧下表达无明显变化.4.相关性分析表明,乏氧下HIF-2α mRNA与蛋白表达呈正相关(r=0.989,P=0.011);而HIF-1α和HIF-β mRNA与蛋白无相关性. 结论 肺癌细胞中HIF-1α、HIF-2α和HIF-β对乏氧刺激表现出不同的应答方式且具有细胞特异性,乏氧对HIF-1α和HIF-2α的调控可能分别发牛在翻译和转录水平,而对HIF-β无明显的调控作用.
关键词： 肺癌细胞系 乏氧 乏氧诱导因子 反转录-聚合酶链式反应 免疫印迹法 -
原代培养人肺癌相关成纤维细胞对肺癌细胞放射敏感性影响研究
目的 探讨在体外直接接触共培养条件下人肺癌相关成纤维细胞(CAF)对肺癌细胞系放射敏感性的影响.方法 采用人肺癌组织进行原代培养后获取人肺CAF,采用免疫荧光技术鉴定.CAF与肺癌细胞系A549、H1299进行直接接触共培养,采用细胞克隆形成实验观察其对肺癌细胞系放射敏感性的影响.结果 新鲜人肺腺癌经组织块贴壁法原代培养出可稳定传代的CAF,其特异表达α-平滑肌肌动蛋白、波行蛋白和成纤维细胞活化蛋白,而无细胞角质蛋白-18表达.在0 Gy照射时单独组和共培养组A549细胞的克隆形成率分别为(20.0±3.9)％和(32.3±5.5)％(P＜0.05),H1299细胞的分别为(20.6±3.1)％和(35.2±2.3)％(P＜0.05).单独组和共培养组A549细胞的SF2分别为0.727 ±0.061和0.782±0.089(P＞0.05),H1299细胞分别为0.692±0.065和0.782±0.037(P＞0.05);人肺CAF对A549、H1299细胞的放射保护增益比分别为1.29和1.25.结论 人肺CAF与肺癌细胞系直接接触共培养后使肺癌细胞放射敏感性降低,原因可能为CAF促进了肿瘤细胞增殖.
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肝激酶B1增强肺癌H460细胞放射敏感性的体内研究
目的 研究肝激酶B1(LKB1)对肺癌H460细胞裸鼠皮下移植瘤放射敏感性的影响.方法 构建肺癌H460细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分别给予空载质粒(pEGFP-Ctrl)、照射+空载质粒(IR+pEGFP-Ctrl)、过表达LKB1质粒(pEGFP-LKB1)、照射+过表达LKB1质粒(IR+pEGFP-LKB1)处理;观察移植瘤生长情况,计算抑瘤率及放射增敏比;并采用免疫组织化学和蛋白印记技术检测各组瘤组织中LKB1表达情况,分析LKB1与放射敏感性的关系.结果 相较于pEGFP-Ctrl组,IR+pEGFP-Ctrl组、pEGFP-LKB1组和IR+pEGFP-LKB1组的肿瘤生长都受到不同程度的抑制,抑瘤率分别为31.30%、14.78%和43.48%,其中IR+pEGFP-LKB1组较其他组为明显.IR+pEGFP-LKB1组LKB1的放射增敏系数为1.18.转染pEGFP-LKB1组的LKB1在免疫组织化学和蛋白印记水平上表达增高,其余组未见LKB1表达.结论 成功构建肺癌H460细胞裸鼠皮下移植瘤模型,LKB1具有增强肺癌H460细胞裸鼠皮下移植瘤放射敏感性作用.
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STAT-3介导的非依赖VEGFR-2通路对NSCLC细胞放射敏感性影响的研究
目的 研究抑制STAT-3对非依赖VEGFR-2通路的NSCLC细胞放射敏感性的影响,并探讨其可能机制.方法 采用Q-PCR及蛋白印迹法检测各组中VEGFR-2、STAT-3相关信号分子及HIF-1α、CyclinD1 mRNA与蛋白表达变化;克隆形成实验检测各组细胞放射敏感性,流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布.结果 经VEGFR-2抑制剂Apatinib处理后,Calu-1细胞中VEGFR-2、STAT-3 mRNA无显著变化,HIF-1α、CyclinD1 mRNA表达降低;联合STAT-3抑制剂S3I-201后,VEGFR-2、STAT-3及下游相关基因mRNA表达降低(F=304.54、118.99,P<0.01);VEGFR-2、STAT-3及下游相关靶蛋白磷酸化水平均降低(F=144.34、529.66,P<0.01);细胞凋亡率与G2+M期阻滞增加,同时抑制STAT-3和VEGFR-2组更明显(F=72.37,P<0.01).与Calu-1细胞相比,A549细胞加Apatinib抑制VEGFR-2细胞放射增敏效果有限,SER=1.39;联合S3I-201抑制STAT-3后,放射增敏效果显著,SER=1.72(t=-48.61,P=0.000).结论 NSCLC细胞VEGFR-2被抑制时,旁路活化的STAT-3直接和间接调控CyclinD1表达,进而影响肺癌细胞的放射敏感性,联合抑制肺癌细胞VEGFR-2和STAT-3,具有良好的放射增敏效果.
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肺癌放射抗性细胞系构建及生物行为研究
目的：构建肺癌放射抗性细胞系，观察细胞在形态、凋亡、侵袭迁移能力和上皮间质转化的改变。方法采用小剂量等分割照射法、亚致死剂量照射法及梯度递增照射法筛选肺癌A549和H1299放射抗性细胞系，显微镜下观察细胞形态学改变，克隆形成实验检测放射敏感性，CCK?8法检测细胞受照后存活率；流式细胞仪检测凋亡率；Transwell实验检测细胞侵袭迁移能力的变化；蛋白印迹法检测上皮间质转化标志蛋白表达。结果梯度递增照射法构建肺癌放射抗性细胞系可行性好，得到放射抗性细胞A549R和H1299R，形态学观察示放射抗性细胞向间质细胞形态转变。分别以A549和H1299细胞为对照，A549R和H1299R细胞D0、Dq、SF2增加（P＝0．017和0．033、0．001和0．000、0．000和0．008），α和α／β值减少（ P＝0．018和0．001、0．007和0．009）。 A549R和H1299R细胞在不同照射剂量下存活率均大于对照组（P值均＜0．05），受照后凋亡率降低（P＝0．02和0．01），侵袭率及迁徙率增高（ P＝0．000和0．001及0．001和0．002），E?钙黏蛋白表达下调和波形蛋白表达增高（ P＝0．00和0．01及P＝0．02和0．01）。结论成功构建肺癌放射抗性细胞系，其侵袭迁移能力增强，并且可能与上皮间质转化有关系。
关键词： 肺癌细胞系 放射抗性 克隆形成分析 Transwell细胞分析 上皮间质转化 -
蛋白激酶CK2抑制剂对肺癌细胞系放射敏感性的影响
目的：探讨蛋白激酶CK2抑制剂对肺癌细胞系放射敏感性的影响。方法通过蛋白印迹法检测蛋白激酶CK2α、β亚基在不同肺癌细胞系中的表达情况。平板克隆形成试验检测CK2激酶抑制剂醌茜素对肺腺癌细胞A549和大细胞肺癌细胞H460对X线的放射敏感性影响。流式细胞术检测醌茜素与X线联合作用对A549、H460细胞凋亡及周期分布影响。组间比较采用方差分析和成组t检验。结果蛋白激酶CK2α、β亚基在对放射不敏感的A549、H1650、H460细胞中高表达，而在放射敏感的小细胞肺癌H446细胞中低表达。使用醌茜素预处理的A549、H460细胞存活分数（ SF）明显低于未处理组，25μmol／L的增敏比（ D0值比）分别为2．771、2．463。醌茜素可引起细胞凋亡增加，但X线联合醌茜素与单独醌茜素作用相比未增加A549细胞和H460细胞凋亡（ X线照射＋醌茜素：单独醌茜素，A549细胞P＝0．487和H460细胞P＝0．254），然而X线联合醌茜素与单独X线照射或醌茜素作用相比可明显引起其G2＋M期阻滞（ X线照射＋醌茜素：单独X线照射，A549细胞P＝0．000，H460细胞P＝0．0024；X线照射＋醌茜素：单独X线照射，A549细胞P＝0．000，H460细胞P＝0．000）。结论通过醌茜素抑制蛋白激酶CK2活性可增加NSCLC细胞的放射敏感性。
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辐射相关基因芯片的制备及其在肺癌细胞中的应用
目的寻找参与肺癌细胞辐射抗性的基因.方法构建辐射相关的基因芯片,初步筛选出在不同辐射敏感性肺癌细胞系中差异表达的基因.为了评价芯片结果的可靠性,我们对一些差异表达基因进行了RT-PCR验证.结果和辐射敏感的NCI-H446细胞相比,辐射抗性的A549中有18个基因有明显的改变,8个基因是上调,10个基因是下调.在照射后6 h和24 h,A549细胞中分别有22个基因(19个基因上调,3个下调)和26个基因(8个上调,18个下调)的差异表达;NCI-H446细胞中分别有17个基因(9个基因上调,8个下调)和18个基因(6个上调,12个下调)差异表达.从这些基因中,我们发现一些参与细胞增殖和抗凋亡的基因,在照射后的A549细胞中是增高的,而在NCI-H446细胞中是降低的.另外一些参与DNA修复的基因,在A549中比在NCI-H446细胞中有更高的表达.结论一些参与细胞DNA修复、细胞周期调控、细胞增殖和抗凋亡作用的基因可能有助于A549细胞辐射抗性的形成.
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采用基因表达谱芯片筛选肺癌细胞系差异表达基因的初步探讨
目的:探讨基因芯片技术分析高低不同转移能力肺癌细胞系的差异表达基因.方法:采用基因芯片技术检测具有高低不同转移能力的肺癌细胞系BE-1和LH-7的差异表达基因.抽提细胞mRNA,利用荧光标记dUTP逆转录制备cDNA探针,与人肺癌表达谱基因芯片杂交,以ScanArray 4000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,获得的荧光信号图像用计算机分析,每点上两种荧光信号的强度分别代表Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的量,后计算每点的Cy5和Cy3的比值.结果:在所检测的人高低肺癌转移细胞系BE-1和LH-7中,20个基因有表达差异,其中高表达14条,低表达6条.结论:基因芯片技术为筛选人类肺癌转移基因提供了有效方法.
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C-myc反义寡核苷酸对肺癌细胞生长增殖及其端粒酶活性抑制作用的观察
目的:探讨硫代磷酸修饰型反义核酸封阻C-myc基因,抑制癌细胞代谢、生长的作用.方法:培养端粒酶高活性的人肺癌细胞系LTEP-a-2,合成针对C-myc基因的硫代反义寡核苷酸封条和随机序列寡核苷酸片断,导入LTEP-a-2细胞系,作用72h,分析反义封条对细胞端粒酶,琥珀酸氧化脱氢酶(SDH),DNA合成和细胞增殖的作用.结果:C-myc反义封条PS-ODN12 5μmol/L抑制LTEP-a-2细胞34.87%的端粒酶活性;10μmol/L抑制62.71%端粒酶活性;20 μmol/L抑制89.18%端粒酶活性.反义封条PS-ODN12还有抑制LTEP-a-2增殖(39.22%～85.29%)和SDH活性(42%～80%)作用.其对DNA合成亦有抑制作用(71.49%～87.35%).随机序列硫代修饰寡核苷酸PS-ODN920μmol/L仅抑制LTEP-a-2细胞2.37%端粒酶活性,抑制4.5%的细胞增殖和4%SDH活性.结论:C-myc反义封条对肺癌细胞LTEP-a-2的增殖、端粒酶活性有特异性抑制作用,并呈剂量依赖关系.
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转化生长因子β1对TH免疫及肺癌细胞系生长的影响
目的:研究并分析转化生长因子β1(TGFβ1)对TH细胞免疫的作用以及对肺癌细胞系生长的影响.方法:利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了体外培养的外周血单个核细胞在TGFβ1作用下TH1和TH2型细胞因子的分泌;利用MTT比色法了解TGFβ1对肺腺癌细胞系(A549)生长的影响.结果:在TGFβ1作用下,健康者外周血单个核细胞培养上清液中IL-2和INFY水平(329.6±125.9pg/ml,687.36±209.78pg/ml)明显低于无TGF β1作用的健康人组(696.11±123.86pg/ml,941.06±191.18pg/ml)(P＜0.001),却显著高于非小细胞肺癌患者(128.64±14.82pg/ml,447.6±160.02pg/ml)(P＜0.001);IL-10水平(500.28±82.11pg/ml)高于健康对照组(341.25±134.83pg/ml)(P＜0.001),与肺癌组(524.16±144.27pg/ml)相比却差异显著(P＝0.23).TGFβ1对A549的生长没有影响(P＝0.42,P＝0.80).结论:TGF β1能引起TH细胞免疫失衡;抑制TH1细胞免疫,增强TH2细胞免疫;TGFβ1对A549生长无影响.
关键词： TGFβ 1TH1和TH2型细胞免疫 非小细胞肺癌 肺癌细胞系 -
Slp2反义真核表达载体的构建及功能研究
背景与目的 肺癌相关基因的研究一直是研究的热门课题,Slp2基因是通过cDNA微阵列技术筛选出的肺癌差异表达基因之一,本研究旨在对Slp2基因在肺癌细胞系中的表达及其功能进行初步研究.方法 提取肺癌细胞系A549、GLC-82、NCI-H446、NCI-H460的细胞总RNA,用RT-PCR方法检测肺癌细胞系中Slp2基因mRNA水平的表达;构建Slp2反义基因,通过离子脂质体将克隆的Slp2反义基因导入肺癌细胞系GLC-82、NCI-H446、NCI-H460,用半定量RT-PCR检测转染目的基因对肺癌细胞系Slp2表达的影响;通过四唑盐比色法绘制细胞生长曲线以及流式细胞分析、软琼脂细胞克隆形成试验,观测转染Slp2反义基因对肺癌细胞系GLC-82、NCI-H446、NCI-H460生长速度、细胞周期以及细胞增殖能力的影响.结果 在4个肺癌细胞系中,Slp2基因均为阳性表达;转染Slp2反义基因后的肺癌细胞系GLC-82、NCI-H446、NCI-H460的细胞生长速度明显减慢;在流式细胞分析直方图上表现为G2期的细胞增多,并曾在转染目的基因的NCI-H446细胞流式直方图中观察到了位于G0/G1期左侧的"亚G1峰"的出现;转染Slp2反义基因后肺癌细胞系的软琼脂培养细胞克隆形成率明显低于未转染细胞.结论 Slp2基因与肺癌细胞的生长、增殖力密切相关,有必要进行深入研究和探讨.
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T-bet对肺癌细胞系(Lewis细胞)致瘤作用的体内干预研究
目的:探讨T-bet质粒局部应用对小鼠肺癌细胞皮下移植瘤的干预作用.方法:将传代培养的Lewis肺癌细胞接种于小鼠右肩部皮下,制备荷瘤小鼠模型;瘤内分别注射PIRES-eGFP/mT-bet(m指小鼠)、PIRES-eGFP质粒和PBS,观察各组小鼠存活时间,肿瘤体积的变化;HE染色观察肿瘤组织的病理变化;Western blot检测肿瘤组织T-bet的表达,QRT-PCR检测肿瘤组织T-bet和IFN-γ的mRNA水平.结果:瘤内注射T-bet质粒载体后Western blot检测发现,肿瘤组织T-bet蛋白表达显著高于对照组;QRT-PCR结果显示,肿瘤组织T-bet和IFN-,γ的mRNA水平呈上升趋势,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).T-bet质粒干预组小鼠肿瘤生长明显缓慢,存活期延长.HE染色组织病理观察可见mT-bet干预组小鼠局部组织淋巴细胞大量浸润.结论:T-bet基因局部注射可延缓小鼠肺癌Lewis皮下移植瘤的生长,提高机体的抗肿瘤免疫应答能力,增强对已发肿瘤的生长限制作用,为T-bet应用于肿瘤治疗积累试验数据.
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HMGA2在肺癌细胞系中的表达及与转移的相关性
目的：检测在肺癌细胞系中HMGA2的表达及分布情况并分析其与肺癌细胞转移能力间的关系。方法：采用Western blot、RT-PCR方法检测肺癌细胞系A549、BE1、LH7、95-D、95-C中HMGA2蛋白及mRNA的表达并和人支气管上皮细胞系HBE进行对比，结果由计算机图像系统采集并分析。结果：Western blot检测HMGA2蛋白在肺癌细胞系中过表达，而在人支气管上皮细胞系弱表达。而Western blot和RT-PCR结果均显示高转移能力的BE1和95-D 肺癌细胞系的表达强于低转移能力的LH7和95-C肺癌细胞系（ p<0.05）。结论：HMGA2表达在肺癌细胞中显著高于正常上皮细胞，其表达水平与细胞的转移能力正相关。HMGA2的过表达可能促进肺癌的转移。
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艾迪对人肺癌不同转移表型细胞系常用化疗药敏感性的影响
目的探索艾迪对人肺癌不同表型细胞系常用化疔药敏感性的影响.方法采用人肺癌不同表型细胞系,用不同浓度的ADM、MMC和CBP等化疗药物处理细胞,观察艾迪对化疗药物的增敏作用.结果除CBP加艾迪后对AGZY的半数致死浓度与单药比有所增加外,其它各组半数致死浓度均有不同程度的降低.在两细胞系中,MMG加艾迪在浓度为3.0μg/ml组其增敏作用明显.ADM各浓度组加艾迪后,对Anip973细胞系均有程度不同的增敏作用;而AGZY细胞系只有2.0μg/ml组增加抑制率15.56%,其他各浓度组变化不明显.CBP低浓度时加艾迪对Anip973有明显增加抑制率作用,对AGZY则没有明显的增敏作用.结论艾迪对ADM和MMC具有一定的增敏作用,对不同转移表型和不同药物浓度其增敏作用不同.
